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Neurociência

マウス脳血管の精製

Published: November 10, 2015
doi:
10.3791/53208
, , ,
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241,Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie,Université Paris Diderot

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

脳内、血管系の大部分は、選択的障壁から成り、脳と血液との間の分子および免疫細胞の交換を調節する血液脳関門（BBB）。また、巨大なニューロンの代謝要求は、血流のその時々の規制が必要です。注目すべきは、これらの規制の異常が最も脳の病理の病原特徴です。 、脳腫瘍、ならびに、多発性硬化症、髄膜炎、および敗血症によって誘発される脳機能障害のような炎症状態：神経膠芽腫、脳梗塞、浮腫、てんかん、変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病例）を含みます。このように、脳血管生理機能を調節するシグナル伝達事象を理解することは大きな課題です。脳血管系を構成する種々の細胞型の細胞および分子の性質に非常に洞察を新たに分離した脳組織から選別初代培養または細胞から得ることができます。しかし、このような細胞極性、形態や細胞間の関係のような特性は、このような製剤中で維持されていません。ここで説明するプロトコルは、構造的完全性を維持しながら、脳血管断片を精製するために設計されています。我々は、単離された血管が連続基底膜で囲まれているタイトジャンクショ​​ンで封止された内皮細胞から構成されていることを示しています。周皮細胞、平滑筋細胞ならびに血管周囲のアストロサイトのエンドフィートの膜は、内皮層に付着したままです。最後に、精製された脳血管に免疫染色実験を実行する方法について説明します。

Introduction

中枢神経系（CNS）の適切な機能は、高度に調節された細胞外環境を必要とし、その代謝要求は、他の臓器1に比べて巨大です。 CNSはまた、一般的に末梢器官に無害それに、神経毒性の化学物質の広い範囲、に非常に敏感です。正しい機能を保証するために、CNS「血管系のほとんどは、内皮障壁を形成します。分子およびイオンの流れ、並びに、血液と脳の間の免疫細胞の通過を制御する血液脳関門（BBB）は、このようにして治療を妨げ、それによって適切な2ホメオスタシスを維持するだけでなく、治療薬の侵入を制限します神経疾患の3。細胞レベルでは、BBBは、主に内皮細胞、排出トランスポーターの偏発現と非常に低いトランスサイトーシス率4との間に大規模なタイトジャンクションによって維持されます。 BBBの性質や機能は、主にNEによって誘導されますighboring細胞4。具体的には、周皮細胞は、BBB 5,6を誘導し、維持する上で重要な役割を果たしています。大血管の周囲の平滑筋細胞がそうであるように、収縮された細胞、周皮細胞は、血液の流れ7を制御します 。最後に、アストロサイト、脳の主要なグリア細胞、脳血管系8のほとんどの周りにエンドフィートという名前の大きなプロセスを送信し、BBBの完全性と免疫静止9を調節し 、ニューロン10の代謝物の転送、および神経活動の間に緊密な結合を誘導し、血流11,12。

脳血管系の分子や細胞の性質を研究する能力は、脳生理学や生理病理への貢献をより良く特徴付けることが重要です。この質問に取り組むためには、脳の脳血管系を隔離するための戦略は、無傷の脳血管フラグメントの調製を可能にする、開発されています。脳血管Purificationは当初、特にげっ歯類14で、他の種にウシ脳13を用いて説明し、改善し、適応させました。この最後の研究では、様々なサイズのフィルターの使用は、異なる直径の容器内で濃縮画分に脳血管を分離するために導入されました。興味深いことに、このような製剤には、内皮細胞は、それらの代謝特性15、トランスポーターの機能16と、偏光17を保ちました。ここでは、具体的に、このプロトコルを記述し、さらに単離血管が自分の中でその場構造のほとんどを維持することを示しています。内皮細胞は、タイトジャンクショ​​ンによってリンクされ、連続的な基底膜に囲まれたままです。周皮細胞および平滑筋細胞、内皮層、ならびに血管周囲の星状細胞膜に付着したままです。しかし、アストロサイト、ミクログリア細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトが排除されます。最後に、我々は、単離された脳血管に免疫染色を行うための手順を説明します。 </P>

これまで脳血管系に関わる分子および細胞研究のほとんどは、細胞選別細胞特異的レポーターマウス系統または免疫染色に基づく手順18,19を使用して精製した解離脳血管細胞上で行われています。これらの技術は、ほぼ純粋な脳血管細胞集団の単離のために可能にするが、単離された細胞は、完全に順番に、非常にそれらの分子や細胞の特性に影響を与える彼らのその場での形態との相互作用を、失います。分離された脳血管の全体的な構造は、それらの分子特性に影響を小さく、したがって、保存されているとして、ここで説明されたプロトコルは、特異的な抗体またはトランスジェニックマウスの汚れの必要のない全脳血管の断片を単離を可能にする、優れた代替手段を提供しています。最近20,21に記載のように単離された容器は、その後BBBにおける遺伝子活性、タンパク質合成および調節を研究するために使用されるかもしれません</suP>。最後に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション22,23と比較して、本発明のプロトコルは、安価で実行が容易で、任意の研究室に急速に適応可能です。

Protocol

1.ソリューションと材料分離容器の溶液を調製する：B1、HBSSの150ミリリットルにHEPES 1M、1.5mlのを追加します。 B2、B1の20ミリリットルにデキストラン3.6gのを追加します。 B3は、B1の100mlに、BSAの1グラムを追加します。 上部のネジ止め部分から下部を切断してフィルターホルダーを変更します。 免疫染色ソリューション準備：固定液、pH7.4のPBS中4％パラホルムアルデヒド?…

Representative Results

ここでは、脳血管14の機械的な分離を可能にするプロトコルを記述している。 図1は、この技術の主な手順をまとめたものです。脳血管の構造は複雑であり、いくつかの細胞型を含む、すなわち、内皮細胞のタイトジャンクションによって密封され、周皮細胞、平滑筋細胞、および星状細胞の足突起9によって囲ま。このように、脳血管の単離後、私たちは?…

Discussion

血液脳関門は、CNSの中と外の生理学的物質の通過を調節し、血液中に存在する潜在的に有害な物質に対してそれを保護します。これは、神経変性疾患2と脳腫瘍28を含む、いくつかの中枢神経系の病態に関与しています。 BBBの極めて低い透過性はまた、神経細胞を標的治療薬の通過妨げと可逆的に脳のための有害な結果を伴うBBBを開くしようとする方法の開発は、研究3</sup…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、Labex MemoLifeによっておよびARSEPによってサポートされていました（財団はラRECHERCHEシュル・ラ・硬化させるアンプラークàL'補佐官を注ぎます）

Materials

Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
PBS 10X Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton™ X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2000
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Referências

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Boulay, A., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).
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