We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
I hjärnan är de flesta av det vaskulära systemet består av en selektiv barriär, blod-hjärnbarriären (BBB), som reglerar utbytet av molekyler och immunceller mellan hjärnan och blodet. Dessutom kräver den stora neuronala metaboliska efterfrågan ett ögonblick till ögonblick reglering av blodflödet. Noterbart är, avvikelser i dessa föreskrifter är etiologiska kännetecken flesta hjärn sjukdomar; inklusive glioblastom, stroke, ödem, epilepsi, degenerativa sjukdomar (ex: Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom), hjärntumörer, liksom inflammatoriska tillstånd såsom multipel skleros, hjärnhinneinflammation och sepsis inducerad hjärn dysfunktioner. Således, förstå de signaleringshändelser som modulerar cerebrovaskulär fysiologi är en stor utmaning. Mycket insikt i de cellulära och molekylära egenskaper hos de olika celltyper som utgör det cerebrovaskulära systemet kan fås från primär kultur eller cellsortering från nyligen dissocierade hjärnvävnad. Dock,egenskaper såsom cellpolaritet, morfologi och inter relationer inte upprätthålls i sådana preparat. Protokollet som vi beskriver här är utformad för att rena hjärnfartygsfragment, samtidigt som strukturell integritet. Vi visar att isolerade kärl består av endotelceller förseglats av tight junctions som är omgivna av en kontinuerlig basal lamina. Pericyter, glatta muskelceller samt perivaskulära astrocyternas endfeet membran sitter kvar endotelskiktet. Slutligen beskriver vi hur du utför immunfärgning experiment på renade hjärn fartyg.
Korrekt funktion av det centrala nervsystemet (CNS) kräver en starkt reglerad extracellulär miljö, och dess metaboliska krav är stora jämfört med andra organ 1. CNS är också extremt känsliga för ett brett spektrum av kemikalier, i allmänhet ofarliga för perifera organ, men att det, neurotoxiskt. För att säkerställa korrekt funktion, de flesta av CNS "kärl bildar en endotel barriär; blod-hjärnbarriären (BBB), som styr flödet av molekyler och joner samt passage av immunceller mellan blodet och hjärnan, och därigenom bibehålla korrekt homeostas 2, men även att begränsa inträdet av terapeutiska läkemedel, på så sätt hämmar behandlingar av neurologiska störningar 3. På cellnivå är BBB främst stöds av omfattande täta förbindelser mellan endotelceller, polariserade uttryck av utflödes transportörer och en mycket låg transcytos hastighet 4. Egenskaper och funktioner hos BBB är mestadels induceras av neighboring celler 4. Särskilt pericyter spela en viktig roll vid inducering och bibehållande av BBB-5,6. Att kontraktila celler, pericyter reglerar också blodflödet 7 som gör glatta muskelceller som omger stora fartyg. Slutligen, astrocyter, de stora gliaceller i hjärnan, skicka stora processer heter endfeet runt större delen av hjärnan kärl 8 och modulera BBB integritet och immun quiescence 9, överföring av metaboliter neuroner 10, och förmå den täta kopplingen mellan neuronal aktivitet och blodflödet 11,12.
Möjligheten att studera de molekylära och cellulära egenskaper hos cerebrovaskulära systemet är avgörande för att karakterisera bättre dess bidrag till hjärnan fysiologi och patofysiologi. För att ta itu med denna fråga, har strategier för att isolera hjärnans cerebrovaskulär system utvecklats, som gör det möjligt för framställning av intakta hjärnfartygsfragment. Cerebral kärl purification ursprungligen beskrivas med nötkreatur hjärnor 13 och förbättras och anpassas till andra arter, i synnerhet gnagare 14. I denna sista studie användning av filter av varierande storlek införts för att separera hjärnan fartyg till fraktioner anrikade på fartyg av olika diametrar. Intressant i sådana preparat, endotelceller hållit sina metaboliska egenskaper 15, transportör funktionalitet 16 och polarisering 17. Här beskriver vi i detalj detta protokoll och ytterligare visar att isolerade fartyg behålla de flesta av deras in situ strukturer. Endotelceller förblir förenade genom tight junctions och omgiven av en kontinuerlig basal lamina. Pericyter och glatta muskelceller sitter kvar endotelskiktet, liksom perivaskulära astrocyternas membran. Emellertid är astrocyter mikrogliaceller, nervceller och oligodendrocyter elimineras. Slutligen beskriver vi ett förfarande för att utföra immunfärgning på isolerade hjärn fartyg. </p>
Hittills har de flesta av de molekylära och cellulära studier beträffande cerebrovaskulära systemet har utförts på renade hjärnkärlceller dissocierade genom cellsortering med hjälp av cellspecifika reporter musstammar eller immunfärgning baserade förfaranden 18,19. Även om dessa tekniker möjliggör för isolering av nästan rena cerebrovaskulära cellpopulationer, isolerade celler förlorar helt deras de situ-morfologi och interaktioner, vilket i sin tur, påverkar i hög grad deras molekylära och cellulära egenskaper. Protokollet som beskrivs här, vilket möjliggör isolering av hela cerebrovaskulära fragment utan behov av specifika antikroppar eller transgena mus fläckar, erbjuder ett bra alternativ eftersom den övergripande strukturen av isolerade cerebrala kärl är konserverad på så sätt, vilket minskar återverkningar på deras molekylära egenskaper. Isolerade fartyg kan sedan användas för att studera geners aktivitet, proteinsyntesen och reglering på BBB som nyligen beskrivits 20,21 </sup>. Slutligen, jämfört med laser capture microdissection 22,23 det nuvarande protokollet är billigt, lätt att utföra och snabbt anpassas för att alla laboratorier.
Blod-hjärnbarriären reglerar passage av fysiologiska ämnen i och ut ur CNS och skyddar den mot potentiellt skadliga ämnen som finns i blodet. Det är involverad i flera CNS-patologier, inklusive neurodegenerativa sjukdomar 2 och hjärntumörer 28. Den extremt låga permeabilitet BBB hämmar också passagen av läkemedel inriktade på neurala celler och utveckling av metoder för avsikt att reversibelt öppna BBB utan skadliga konsekvenser för hjärnan är ett mycket aktivt forskningsområde <s…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Labex MemoLife och av ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose sv plack)
Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |