Purificazione delle navi cervello di topo
Summary
We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
Abstract
Nel cervello, la maggior parte del sistema vascolare costituito da una barriera selettiva, la barriera emato-encefalica (BBB) che regola lo scambio di molecole e cellule immunitarie tra il cervello e il sangue. Inoltre, la grande richiesta metabolica neuronale richiede un regolamento momento per momento del flusso sanguigno. In particolare, le anomalie di questi regolamenti sono le caratteristiche distintive eziologici della maggior parte delle patologie cerebrali; compresi glioblastoma, ictus, edema, epilessia, malattie degenerative (es: la malattia di Parkinson, il morbo di Alzheimer), tumori cerebrali, così come le condizioni infiammatorie come la sclerosi multipla, la meningite e sepsi indotta disfunzioni cerebrali. Pertanto, la comprensione degli eventi di segnalazione che modulano la fisiologia cerebrale è una sfida importante. Molto comprensione delle proprietà cellulari e molecolari dei vari tipi di cellule che compongono il sistema cerebrovascolare può essere acquisita da coltura primaria o separazione delle cellule dal tessuto cerebrale di recente dissociato. Però,proprietà come polarità cellulare, morfologia e rapporti intercellulari non sono mantenuti in tali preparazioni. Il protocollo che descriviamo qui è concepito per purificare frammenti dei vasi cerebrali, mantenendo l'integrità strutturale. Abbiamo dimostrato che i vasi isolati costituiti da cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette che sono circondati da una lamina basale continuo. Periciti, cellule muscolari lisce e le membrane astrociti endfeet perivascolari rimangono attaccati allo strato endoteliale. Infine, si descrive come eseguire gli esperimenti di immunoistochimica sui vasi cerebrali purificate.
Introduction
Il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (CNS) richiede un ambiente extracellulare altamente regolato, e le sue richieste metaboliche sono enormi rispetto ad altri organi 1. Il CNS è anche estremamente sensibile a una vasta gamma di prodotti chimici, generalmente innocui agli organi periferici, ma ad esso, neurotossico. Per un corretto funzionamento, la maggior parte del 'vascolare CNS costituisce una barriera endoteliale; la barriera emato-encefalica (BBB), che controlla il flusso di molecole e ioni così come il passaggio di cellule immunitarie tra il sangue e il cervello, mantenendo quindi una corretta omeostasi 2, ma anche limitando l'ingresso di farmaci terapeutici, trattamenti ostacolano pertanto di disturbi neurologici 3. A livello cellulare, il BBB è sostenuta principalmente da ampi giunzioni strette tra le cellule endoteliali, espressione polarizzata dei trasportatori di efflusso e un tasso molto basso transcitosi 4. Proprietà e funzioni del BBB sono per lo più indotte da NEcellule ighboring 4. In particolare, periciti svolgono un ruolo importante nel indurre e mantenere la BBB 5,6. Essendo le cellule contrattili, periciti regolano anche il flusso di sangue 7 come le cellule della muscolatura liscia che circondano i grandi vasi. Infine, astrociti, le principali cellule gliali del cervello, inviano grandi processi denominati endfeet intorno la maggior parte del sistema vascolare cerebrale 8 e modulare l'integrità BBB e quiescenza immunitario 9, il trasferimento di metaboliti di neuroni 10, e indurre l'accoppiamento stretto tra l'attività neuronale e il flusso di sangue 11,12.
La possibilità di studiare le proprietà molecolari e cellulari del sistema cerebrovascolare è fondamentale per caratterizzare meglio il suo contributo alla fisiologia del cervello e fisiopatologia. Per affrontare questo problema, sono state sviluppate strategie per isolare il sistema cerebrovascolare del cervello, che consentono per la preparazione di frammenti dei vasi cerebrali intatti. Cerebral nave purification è stata inizialmente descritta utilizzando cervelli bovini 13 e migliorato e adattato ad altre specie, in particolare roditori 14. In questo ultimo studio, l'uso di filtri di varie dimensioni è stato introdotto per separare vasi cerebrali in per frazioni arricchite in vasi di diametri diversi. È interessante notare che, in tali preparati, le cellule endoteliali mantenuto le loro proprietà metaboliche 15, funzionalità trasportatore 16 e 17 di polarizzazione. Qui, descriviamo in dettaglio questo protocollo e inoltre dimostrare che le navi isolate mantengono la maggior parte di loro in strutture in situ. Le cellule endoteliali restano legati da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continuo. Periciti e cellule muscolari lisce rimangono attaccati allo strato endoteliale, così come membrane astrociti perivascolari. Tuttavia, astrociti, cellule microgliali, neuroni e oligodendrociti sono eliminati. Infine, si descrive una procedura per eseguire immunocolorazione sui vasi cerebrali isolate. </p>
Fino ad ora la maggior parte degli studi molecolari e cellulari riguardanti il sistema cerebrovascolare sono stati eseguiti su cellule dei vasi cerebrali purificate dissociati da cellule di smistamento utilizzando cellulari specifici ceppi di topi giornalista o procedure basate immunocolorazione-18,19. Sebbene queste tecniche consente l'isolamento delle popolazioni cellulari quasi puro cerebrovascolari, cellule isolate perdono completamente la loro morfologia e in situ interazioni, che a sua volta, influisce notevolmente le loro proprietà molecolari e cellulari. Il protocollo qui descritto, consentendo l'isolamento di interi frammenti cerebrovascolari senza necessità di anticorpi specifici o macchie di topi transgenici, offre una buona alternativa come la struttura complessiva di isolati vasi cerebrali è conservato, quindi, diminuendo ripercussioni sulla loro proprietà molecolari. Isolato imbarcazioni potrebbero quindi essere utilizzati per studiare l'attività dei geni, la sintesi proteica e la regolamentazione a BBB come recentemente descritto 20,21 </sup>. Infine, rispetto alla cattura microdissezione laser 22,23 il presente protocollo è poco costoso, facile da eseguire e rapidamente adattabile a qualsiasi laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
La barriera ematoencefalica regola il passaggio di sostanze fisiologiche dentro e fuori del sistema nervoso centrale e lo protegge da sostanze potenzialmente nocivi presenti nel sangue. E 'coinvolto in diverse patologie del sistema nervoso centrale, tra cui le malattie neurodegenerative 2 e tumori cerebrali 28. La bassissima permeabilità della BBB ostacola anche il passaggio di agenti terapeutici mirati cellule neurali e lo sviluppo di metodi che intendono aprire reversibilmente BBB senza cons…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal LABEX MemoLife e dal ARSEP (Fondazione per l'aide à la recherche sur la sclérose en placche)
Materials
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
| Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |
Referências
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