JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

In vitro Generation af murint Plasmacytoide dendritiske celler fra fælles Lymfoid progenitorer ved hjælp af AC-6 Feeder System

Published: November 23, 2015
doi:
10.3791/53211
, ,
1Graduate Institute of Immunology,National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Biochemistry,Chang Gung University College of Medicine, 3Molecular Medicine Research Center,Chang Gung University College of Medicine

Summary

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Abstract

-plasmacytoide Dendritiske celler (pdCs) er stærke type I interferon (IFN-i) producerende celler, der aktiveres som reaktion på infektion eller under inflammatoriske reaktioner. Desværre undersøgelse af PDC-funktionen er hæmmet af deres lave frekvens i lymfoide organer, og eksisterende metoder til in vitro-DC generation overvejende favorisere produktionen af CDCS løbet pdCs. Her præsenterer vi en unik tilgang til effektivt at generere pdCs fra fælles lymfoide progenitorer (CLPs) in vitro. Specifikt protokollen beskrevet detaljer, hvordan man oprense CLPs fra knoglemarv og generere pdCs ved co-dyrkning med y-bestrålet AC-6 fødeceller i nærværelse af Flt3 ligand. En unik egenskab ved denne kultur-systemet er, at CLPs migrere nedenunder AC-6 celler og bliver brostensbelagte område-dannende celler, et afgørende skridt for at udvide pdCs. Morfologisk forskellige DC'er, nemlig pdCs og CDCS, blev genereret efter cirka 2 uger med en sammensætning 70-90% pdCs under optimale betingelser. Typisk er antallet af pdCs genereret ved denne fremgangsmåde er omtrent 100 gange antallet af CLPs podede. Derfor er dette et nyt system med at generere robust det store antal pdCs nødvendige for at lette yderligere undersøgelser af udvikling og funktion af disse celler.

Introduction

Dendritiske celler (DC'er) er professionelle antigenpræsenterende celler, som spiller en vigtig rolle i at kontrollere immunresponser 1. Mens DC'er er heterogene, kan de groft inddeles i to populationer, konventionel DCs (CDCS) og plasmacytoide DCs (pdCs) 2,3. Ud over lymfoide organer, er CDCS og pdCs også fundet i væv, herunder lunge, tarm og hud 2. Morfologi CDCS og pdCs afviger med CDCS udviser dendritceller fremspring og formen af ​​pdCs er mere plasma-celle-lignende. Desuden er den fælles muse DC markering, CD11, mere stærkt udtrykt på CDCS end på pdCs. Desuden kan CDCS opdeles yderligere i CD11 + CD24 – CDCS og CD11b – CD24 + CDCS, som begge udtrykker højere niveauer af MHC klasse II og costimulerende molekyler end gøre pdCs 2. Modne pdCs, på den anden side, har vist sig at udtrykke selektivt Siglec-H og BST2 4. Functionally, CDCS er bedre antigen-præsenterende celler, end er pdCs; dog kan pdCs producere en stor mængde af type I-interferon efter virusinfektion eller inflammatorisk stimulering 5.

Både CDCS og pdCs er kortvarig, og derfor skal der konstant genopfyldes fra stamfædre i knoglemarven (BM) 6,7. Adoptiv overførsel af fælles myeloide progenitorer (CMPs) og fælles lymfoide progenitorer (CLPs) i dødeligt bestrålede mus-viser, at CDCS og pdCs kan genereres fra begge slægter 8-10. Men der er en delmængde af pdCs som udtrykker RAG1 / 2 og besidder omlejrede DJ segmenter på IgH locus 11,12. Disse celler deler også molekylære ligheder med B-lymfocytter, herunder udtryk for B220 markør, nukleinsyre-sensing receptorer (TLR7 / TLR9), og transkriptionsfaktorer (SPIB og Bcl11a) 13, har alle menes at være underskrifter fra den lymfoide afstamning. Derfor CLPs kan være gode valg for in vitro-generering af pdCs grund af afstamning lighed.

Mens hyppigheden af både CDCS og pdCs hos mennesker og mus er meget lav 6, DC'er, især CDCS, kan genereres in vitro fra BM eller progenitorceller i nærvær af cytokiner, såsom GM-CSF 11,14 eller Flt3 ligand (FL ) ved hjælp af feeder-fri systemer 11,15,16. Desværre er det ikke muligt at fremstille store antal af pdCs in vitro under anvendelse FL 11,15,16. Tidligere vi demonstreret, at pdCs effektivt kan genereres in vitro fra CLPs ved hjælp af AC-6 fødesystem 17. Fordelen ved at anvende AC-6 stromacellelinje i kulturen er, at det giver celle-celle-kontakt og udskillelse af cytokiner, der understøtter dannelsen af ​​et stort antal pdCs fra CLPs. Selv om produktionen med dette system er ganske robust, omhyggelig replikation af de procedurer, der er beskrevet nedenfor kræves in For at sikre en effektiv generation af pdCs.

Protocol

C57BL / 6 vildtype-mus blev købt fra National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Alle mus blev avlet og holdt under specifikke patogenfrie betingelser. Protokoller og bruge dyr procedurer blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for National Taiwan University College of Medicine (Tilladelse nummer: 20120075). Desuden forskerne gjort alt for at mindske risikoen for smerte, lidelse eller angst i dyrene, mens de udfører eksperimenter. Alle beskrevne procedurer blev udført ved RT mens iført handsker. …

Representative Results

I alt 4-6×10 7 BM-celler er typisk isoleret fra lårben og skinneben i en 6-8 uger gamle, vildtype C57BL / 6 mus. At sortere ud CLPs de samlede BM-celler farvet med PE-konjugeret antistoffer mod afstamning markører (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy 1.1, NK1.1, TER119 og MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC og anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analyseres og sorteres med en cellesorterer. Den sortering strategi for CLP er vist i figur 1. Typisk 5×10 4 CLPs…

Discussion

Her beskriver vi et in vitro kultursystem for den robuste generation af DC'er og pdCs navnlig fra et lille antal CLPs. Det unikke ved denne dyrkningssystem skyldes anvendelsen af ​​AC-6 celler, en stromacellelinje, som foderautomater. Har vist denne fremgangsmåde for at tilvejebringe ikke kun cytokiner, såsom IL-7, SCF, M-CSF og FL 20, men også celle-celle-kontakt 21 nødvendigt at støtte DC udvikling. AC-6 celler er blevet anvendt tidligere for at lette undersøgelsen af i…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Drs. Markus Manz og Irving Weissman til tilvejebringelse reagenser. Vi anerkender også den service, som den flowcytometrianalyse og Cell Sortering Core Facility for første og anden Core Laboratory ved National Taiwan University College of Medicine og NTU hospital hhv. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-MY3) og National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI og NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).

Tags

Plasmacytoid Dendritic CellsPDCsCommon Lymphoid ProgenitorsCLPsAC-6 Feeder SystemIn Vitro GenerationType I InterferonIFN-ICDCs
check_url/pt/53211?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Chang, S., Pai, L., Lee, C. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image