In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l'AC-6 Alimentatore Sistema
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono di tipo potente che interferone (IFN-I) che producono cellule che si attivano in risposta a infezioni o durante le risposte infiammatorie. Purtroppo, studio della funzione pDC è ostacolato dalla loro bassa frequenza in organi linfoidi, e metodi esistenti per la generazione vitro DC prevalentemente favoriscono la produzione di CDC sopra pDC. Qui vi presentiamo un approccio unico per generare efficientemente pDCs da progenitori linfoidi comuni (CLPS) in vitro. In particolare, il protocollo ha descritto i dettagli come purificare CLPS dal midollo osseo e generano pDCs da coculturing con AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati in presenza di Flt3 ligando. Una caratteristica unica di questo sistema di coltura è che i CLPS migrano sotto le celle AC-6 e diventano cellule territoriali che formano acciottolate, un passaggio fondamentale per l'espansione pDCs. DC morfologicamente distinte, vale a dire PDC e CDC, sono stati generati dopo circa due settimane con una composizione di 70-90% pDCs in condizioni ottimali. Tipicamente, il numero di pDC generati da questo metodo è circa 100 volte del numero di CLPS seminati. Pertanto, questo è un nuovo sistema con cui generare robusto il gran numero di pDC necessarie per agevolare ulteriori studi sviluppo e la funzione di queste cellule.
Introduction
Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene professionale che svolgono un ruolo importante nel controllo risposte immunitarie 1. Mentre DC sono eterogenei, possono essere classificati in due popolazioni, DC convenzionale (CDC) e cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 2,3. Oltre agli organi linfoidi, CDC e pDCs si trovano anche in tessuti tra cui polmone, intestino, pelle e 2. La morfologia di CDC e pDCs differenzia, con CDC espositrici proiezioni dendriti-simili e la forma di pDCs essere più plasma alveolare. Inoltre, il marcatore DC comune topo, CD11c, è più altamente espresso su CDCS che su pDC. Inoltre, CDC può essere ulteriormente suddivisa in CD11b + CD24 – CDC e CD11b – CD24 + CDC, entrambi i quali esprimono alti livelli di MHC di classe II e molecole costimolatorie di fare pDCs 2. PDC mature, d'altra parte, hanno mostrato di esprimere selettivamente Siglec-H e BST2 4. Functionally, CDC sono antigene migliori presentano cellule rispetto sono pDCs; tuttavia, pDCs in grado di produrre una grande quantità di interferone di tipo I dopo l'infezione da virus o la stimolazione infiammatoria 5.
Entrambi i CDC e pDCs sono di breve durata, e di conseguenza, devono essere costantemente rifornite da progenitori all'interno del midollo osseo (BM) 6,7. Trasferimento adottivo di progenitori comuni mieloidi (CMP) e progenitori linfoidi comuni (CLPS) in topi irradiati letalmente dimostra che i CDC e pDCs possono essere generati da entrambe le linee 8-10. Tuttavia, vi è un sottoinsieme di pDC che esprimono RAG1 / 2 e possiedono segmenti DJ riarrangiati al locus IgH 11,12. Queste cellule condividono anche analogie molecolari con linfociti B, tra cui l'espressione del marcatore B220, recettori dell'acido nucleico-sensing (TLR7 / TLR9), e fattori di trascrizione (SPIB e BCL11A) 13, dispone di tutto che si ritiene essere le firme del lignaggio linfoide. Pertanto, CLPs possono essere buone scelte per la generazione in vitro di pDCs causa di lignaggio somiglianza.
Mentre la frequenza sia CDC e pDC negli esseri umani e nei topi è molto basso 6, DC, particolarmente CDC, può essere generato in vitro da BM o progenitori in presenza di citochine quali GM-CSF o 11,14 Flt3 ligand (FL ) utilizzando sistemi privi di alimentazione 11,15,16. Purtroppo, però, non è possibile produrre un gran numero di pDC in vitro su FL 11,15,16. In precedenza abbiamo dimostrato che pDCs possono essere efficacemente generati de vitro da CLPS utilizzando il sistema 17 AC-6 alimentatore. Il vantaggio di usare la linea cellulare stromale AC-6 nel sistema di coltura è che fornisce il contatto cellula-cellula e la secrezione di citochine che supportano la generazione di un gran numero di pDC da CLPS. Anche se la produzione con questo sistema è molto robusto, attento replica delle procedure descritte di seguito i è necessariol fine di garantire la generazione efficiente di pDCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un sistema in vitro in coltura per la robusta generazione di DC, e pDCs in particolare, da un piccolo numero di CLPS. L'unicità di questo sistema di coltura è dovuto all'uso di AC-6 cellule, una linea cellulare stromale, come alimentatori. Questo approccio ha dimostrato di fornire non solo le citochine, come IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, ma anche il contatto cellula-cellula 21 necessario per sostenere lo sviluppo DC. AC-6 cellule sono state usate in precedenza per fac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Drs. Markus Manz e Irving Weissman per la fornitura di reagenti. Riconosciamo inoltre il servizio fornito dal citometria a flusso di analisi e cellulare ordinamento Nucleo Struttura del Primo e del Secondo Nucleo Laboratory presso la National Taiwan University College of Medicine e NTU ospedale, rispettivamente. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e il National Institutes Health Research, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI e NHRI-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
Referências
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
