Studera Microbial gemenskaperna<em> In Vivo</em>: En modell av Host-medierad interaktion mellan<em> Candida albicans</em> Och<em> Pseudomonas aeruginosa</em> I Airways

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

Studera värdpatogen interaktion ger oss möjlighet att förstå de bakomliggande mekanismerna för patogeniciteten under mikrobiell infektion. Prognosen i den mottagande beror på medverkan av en anpassad immunsvar mot patogenen ^1. Immunsvar är komplex och resultaten från samverkan mellan patogener och flera immun eller icke-immuna celltyper ^2. In vitro-studier kan inte karaktärisera dessa interaktioner och fokusera på cell patogen interaktioner. Dessutom, i luftvägarna ^3, särskilt hos patienter med varig kronisk lungsjukdom eller i mekaniskt ventilerade patienter, polymikrobiella samhällen förekommer och försvåra värdpatogen interaktion. Pseudomonas aeruginosa och Candida albicans är både problem patogener ^4, ofta isolerade från trakeobronkiala prover, och associerad med svåra infektioner, särskilt i intensivvårdsavdelning ^5. Mikrobiella interaktioner harrapporterats mellan dessa patogener in vitro men den kliniska effekten av dessa interaktioner är fortfarande oklart ^6. Att studera samspelet mellan C. Albicans och P. aeruginosa, en murin modell för C. albicans airways kolonisering, följt av en P. aeruginosa- medierad akut lunginfektion utfördes.

Introduction

Djurmodeller, speciellt möss, har i stor utsträckning använts för att undersöka immunsvar mot patogener. Även medfödda och förvärvade immuniteten skiljer mellan gnagare och människa ^7, den lätthet i avel och utveckling av knockouts för många gener, göra möss en utmärkt modell för att studera immunsvar ^8. Immunsvaret är komplex och resultat från interaktionen mellan en patogen, bosatta mikrobiella flora och flera immun (lymfocyter, neutrofiler, makrofager) och icke-immuna (epitelceller, endotelceller) cellulära typer ^2. In vitro-studier tillåter inte iaktta dessa komplexa interaktioner och främst fokusera på unika cell-patogen interaktioner. Även djurmodeller måste användas med försiktighet, och begränsad till mycket specifika och aktuella frågor, musmodeller ger en god inblick i däggdjuret immunsvar in vivo och kan ta itu med delar av kliniska viktiga frågor ^7.

<p class="jove_content"> I luftvägarna, är den mikrobiella miljön komplexa associera ett stort antal olika mikroorganismer ^6. Medan vad som utgör en "normal" luftvägs microbiome återstår att bestämmas, bosatta samhällen är ofta polymikrobiella, och kommer från olika ekologiska källor. Patienter med varig kronisk lungsjukdom (cystisk fibros, bronchectasis) eller mekaniskt ventilerade patienter uppvisar en viss flora på grund av kolonisering av luftvägarna genom miljö förvärvade mikroorganismer ^9. Pseudomonas aeruginosa och Candida albicans är både problem patogener ^5, ofta isolerade tillsammans från trakeobronkial prover och ansvarig för svår opportunistisk infektion hos dessa patienter, särskilt i intensivvårdsavdelning (IVA) ^4.

Isolering av dessa mikroorganismer under akut lunginflammation i ICU resulterar i antimikrobiell behandling mot P. aeruginosa But jäst brukar inte vara patogena på denna webbplats ^5. In vitro-interaktioner mellan P. aeruginosa och C. albicans har fått stor uppmärksamhet och visade att dessa mikroorganismer kan påverka tillväxt och överlevnad varandra men studier kan inte avgöra om förekomsten av C. albicans är skadligt eller välgörande för värden ^10. Musmodeller har utvecklats för att ta itu med denna relevans P. aeruginosa och C. albicans in vivo, men samspelet mellan mikroorganismer var inte den viktigaste punkten. I själva verket var den modell som inrättats för att utvärdera medverkan av C. albicans i värdens immunsvar, och utfall.

En tidigare modell som fastställts av Roux et al används redan en initial kolonisering med C. albicans följt av en akut lunginflammation inducerad av P. aeruginosa. Med hjälp av deras modell, författarna hittat en skadlig roll plägsen C. albicans kolonisering ^11. Men Roux et al använde en hög belastning av C. albicans i deras modell med 2 x 10 ⁶ CFU / mus under 3 dagar i följd. Vi etablerade en 4-dagars modell av C. albicans luftvägs kolonisering, eller åtminstone uthållighet utan lungskada, I denna modell C. albicans hämtades upp till 4 dagar efter en enda instillation av 10 ⁵ CFU per mus (Figur 2B) ^12,13. Efter 4 dagar, inga tecken på inflammatorisk cellrekrytering, inflammatorisk cytokinproduktion eller epitelskada observerats. Vid 24-48 timmar, på toppen förekomsten av C. albicans, även om ett cellulärt och cytokin medfödda immunsvaret observerades, det fanns inga tecken på lungskada. Överraskande, möss sålunda koloniserade med C. albicans 48 h före intranasal instillation av P. aeruginosa hade försvagat infektion jämfört med möss med P. aeruginosa infektion enbart. jagndeed, möss uppvisade mindre lungskada och minskad bakteriell belastning ^12,13.

Flera hypoteser kan förklara detta gynnsamma effekten av tidigare kolonisering med C. albicans på P. aeruginosa medierad akut lunginflammation. Först, en mellan arter överhörning omfattar varje mikroorganismer beslutför analys system, den homoserinelactone baserade P. aeruginosa systemet och farnesol baserade C. albicans systemet utvärderades. För det andra, C. albicans fungerar som en "lockbete" mål för P. aeruginosa avleda patogenen från lung epitelceller studerades. Båda hypoteser ogiltig (opublicerade data). Den tredje hypotesen var att en "priming" av det medfödda immunförsvaret av C. albicans ansvarig för en förbättrad efterföljande medfödd respons mot P. aeruginosa. Denna sista hypotes bekräftades. Faktiskt C. albicans kolonisationen ledde till en priming av medfödd immunitet through IL-22, främst utsöndras av medfödda lymfoidceller, vilket resulterar i ökad bakterie clearance och minskad lungskada ^12.

Sammanfattningsvis, är värd en central aktör i samspelet mellan mikroorganismer som modulerar medfödda immunförsvaret och involverar olika inflammatoriska celltyper. Medan dessa komplexa immun interaktioner kan dissekeras in vitro de initiala hypoteser endast kan åstadkommas genom lämpliga in vivo-modeller. Följande protokoll är ett exempel på in vivo-studie av värd-medierad patogen interaktion som kan anpassas till andra mikroorganismer.

Protocol

Den regionala etiska regionkommittén för djurförsök har godkänt denna metod, i enlighet med nationell och internationell djuromsorg och användning i prövnings riktlinjer för forskning. 1. Provtagning Prov lagring Samla alla prover och omedelbart lagra vid – 20 ° C eller på is tills frysförvaring att undvika en försämring. Placera steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is för att förbättra bronkobstruktiva alveolära sköljningar (BAL) prestanda. …

Representative Results

Som tidigare setts under protokollbeskrivningen måste experimentet 5 dag för att slutföra (Figur 1: experiment tidslinje). En operatör beställt under hela körningen av experimentet och kan hantera processer upp till maximalt 10 möss. Om fler djur krävs två personer behövs särskilt för kirurgisk provtagning. I själva verket alla prover ska samlas in under två timmar för att undvika en ökad passiv alveolär-kapillär läckage av FITC-märkt albumin under de senaste möss. <p class="jov…

Discussion

Djurmodeller, speciellt däggdjur, är användbara för att belysa komplexa mekanismer av värdpatogen interaktion inom immunitet. Naturligtvis, behovet av information som endast kan erhållas från djurmodeller måste vara nödvändig; I annat fall måste användningen av djur ersättas med in vitro-modeller. Denna djurmodell illustrerar insikten att endast kan tillhandahållas av en djurmodell eftersom interaktionen mellan patogener förmedlas av ett flerkomponentvärdsvar. Möss som för närvarande används…

Materials

Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47%	CEVA	6742145	100 mL plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µL	Dutscher	10175	x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 mL
amikacin 1g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10 000 UI in 2 mL	Pan pharma	9128701	x 10 per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment