Messraten von Herbizid Metabolism in DICOT Weeds mit einem herausgeschnittenen Blatt Assay

Summary

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Abstract

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Introduction

Herbizidresistenz in Unkraut stellt eine ernsthafte Bedrohung für die globale Produktion von Nahrungsmitteln und Faser ^1,2. Derzeit Tausende von resistenten Populationen und Biotypen von über hundert Unkrautarten weltweit sind dokumentiert und untersucht ^3. Ein Hauptmechanismus, Herbizid-Resistenz verleiht, in Pflanzen ist die Veränderung der Ziel Herbizid-site-Gene und Proteine, einschließlich genetischer Mutationen, herbizid Proteinbindungskinetiken oder Amplifikation der Ziel-Ort-Gen ² beeinflussen. Metabolische Entgiftung über erhöhte Aktivitäten der Cytochrom P450 Monooxygenase (P450) oder Glutathion-S-Transferase (GST) Enzyme ist ein weiterer Mechanismus, der Herbizid-Resistenz in Unkräutern, die verschiedene in mehrfacher Hinsicht vom Ziel-Ort basierten Mechanismen ² verleiht. Metabolic-basierten Widerstand hat erhebliche Auswirkungen auf, ob Pflanzen Fitness-Kosten (auch bekannt als Fitness-Strafen) können aus den Herbizidresistenz mechanis führenm, sowie in Bezug auf das Potential für einen einzigen Entgiftungsmechanismus zum Verleihen kreuz- oder mehreren Herbizid-Resistenz in Unkrautpopulationen ^1,2,4. Allgemeiner kann Herbizid-Metabolismus in Pflanzen in drei Phasen ⁵ geteilt werden. Phase I beinhaltet Herbizidumwandlung oder Aktivierung wie P450 Hydroxylierung von aromatischen Ringen oder Alkylgruppen, oder N – oder O- Dealkylierungsreaktionen, was zu erhöhter Polarität und partiellen Entgiftung Herbizid ^5,6. Neu eingeführten funktionellen Gruppen in Phase I können Verknüpfungsstellen für die Konjugation an reduziertem Glutathion von GSTs bereitzustellen oder durch UDP-abhängige Glycosyltransferasen in Phase II ^5,7 Glucose. Beispielsweise ist die große Anfangs Metabolit Primisulfuron-methyl in Mais hydroxy-Primisulfuron-Methyl ^{8, die} weiter metabolisiert werden können, zu Hydroxy-Primisulfuron-glucosid (Phase II) und dann in der Vakuole zur langfristigen Lagerung oder weitere metabolische transportiert Profibeitung ^5,6 (Phase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) ist ein schwer zu Kontrolle, dicot Jahresunkrautarten, die die Produktion von Mais (Zea mays), Sojabohne (Glycine max) und Baumwolle (Gossypium hirsutum) in den Vereinigten Staaten behindert. Der hohe Grad der genetischen Vielfalt der waterhemp sich durch seine zweihäusig Biologie und Fernwindbestäubung ermöglicht, und eine einzelne weibliche waterhemp Pflanze kann bis zu eine Million Samen ⁹ zu erzeugen. Diese Samen sind klein und leicht verbreiten, was natürlich zu verleihen waterhemp mit einer effektiven Streuvorrichtung. Waterhemp zeigt kontinuierliche Keimung in der gesamten Vegetationsperiode ^9, und ihre Samen sind in der Lage, nach mehreren Jahren der Ruhe keimen. Waterhemp _ein C 4 Pflanze, die eine höhere Wachstumsrate als die meisten breitblättrigen Unkräutern in Ackeranbausystemen ¹⁰ besitzt. Darüber hinaus sind zahlreiche waterhemp Populationen gegen mehrere families von Herbiziden ^3.

Eine Population von waterhemp (bezeichnet MCR) aus Illinois ist beständig gegen 4-Hydroxy-Dioxygenase (HPPD) inhibierende Herbizide ^11, wie Mesotrion, sowie Atrazin und Acetolactatsynthase (ALS) inhibierende Herbizide, einschließlich Primisulfuron-methyl wegen Nichtziel-Website basierten Mechanismen ^12,13. Eine andere Population von waterhemp bezeichnet ACR ^{14, die} Primisulfuron-methyl-resistente (aufgrund einer Mutation in dem ALS-Gen) und Atrazin-resistente aber empfindlich gegen Mesotrion und einem waterhemp Population bezeichnet WCS ^14, die Primisulfuron-methyl empfindlich ist, Mesotrion und Atrazin wurden im Vergleich zu MCR in unserer früheren Forschung ^{12 und} aktuelle Experimente verwendet (in Tabelle 1 zusammengefasst). Erste Studien keine Veränderungen in den HPPD-Gen-Sequenz oder Expressionsniveaus oder verringert Mesotrion Aufnahme zu erfassen, in der MCR-Bevölkerung im Vergleich mit Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen ^12. Allerdings Metabolismus-Untersuchungen mit ganzen Pflanzen zeigten eine signifikant niedrigere Mutter Mesotrion Herbizid in MCR Vergleich ACR und WCS, die mit früheren phänotypische Reaktionen korreliert, um Mesotrion ^11,12.

Waterhemp Bevölkerung	Abkürzung	Phänotyp zu Mesotrion	Mesotrion Resistenzmechanismus	Phänotyp Primisulfuron	Primisulfuron Resistenzmechanismus
McLean Grafschaft-Resistant	MCR	Widerstandsfähig	Metabolism *	Widerstandsfähig	Stoffwechsel
Adams County-Resistant	ACR	Sensitive	–	Widerstandsfähig	Ziel-Ort Mutation in ALS 14
Wayne County-Sensitive	WCS	Sensitive	–	Sensitive	–

* Non-Target-Ort-Resistenzmechanismen, andere als verbessert den Stoffwechsel, können ebenfalls zu verleihen Mesotrion Widerstand in der Bevölkerung MCR ^12.

Tabelle 1: Beschreibung der waterhemp Populationen aus Illinois in dieser Studie verwendet.

Neben der Bestimmung Raten von Herbizidmetabolismus in intakten waterhemp Sämlinge, wurde ein anderer experimenteller Ansatz entwickelt und in unserer früheren Forschung eingesetzt, um den Stoffwechsel, indem ein herausgeschnitten waterhemp Blatt Assay ¹² sowie verschiedene P450-Inhibitoren (zB tetcyclacis und Malathion) zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde speziell für waterhemp aus einem Previ angepaßtous Untersuchung Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel in geschnitten Maisblätter ^15, da die herausgeschnittenen Blatt Test noch nicht für die Durchführung von Herbizidstoffwechselforschung in einer dikotylen Pflanze berichtet. Die organophophosate Insektizid Malathion wurde häufig für in vivo und in vitro herbizidStoffWechselForschung, um P450 Beteiligung ¹⁶ anzugeben. Zum Beispiel, Toleranz und schnellen Metabolismus von Mesotrion bei Mais sind auf P450-katalysierte Ring Hydroxylierung, die überprüft wurde, als Malathion erhöhten Mais Empfindlichkeit auf Mesotrion ^17. In ähnlicher Weise gehemmt Malathion Stoffwechsel der ALS-Hemmer Primisulfuron-methyl in geschnitten Maisblätter ^15. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik ist, dass Daten erzeugt werden, unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster, ein wichtiger Faktor in die Abwägung Metabolismus von systemischen Nachauflaufherbizide in Pflanzen. Folglich ermöglicht dieses Verfahren die quantitative undqualitative metabolischen Analysen auf einer einzigen behandelte Blatt ¹² zu fokussieren.

Eine vegetative Klonierungsstrategie, in Verbindung mit dem ausgeschnittenen Blatt Protokoll wurde vorher in waterhemp verwendet, um Stoffwechselstudien ¹² durchzuführen. Aufgrund der Natur der Auskreuzung waterhemp (getrennte männliche und weibliche Pflanzen) und hohes Maß an genetischer Vielfalt innerhalb zweihäusig Amaranthus Arten ^9, dieses Protokoll gewährleistet, dass genetisch identische waterhemp Sämlinge wurden in den Zeitverlaufsexperimenten untersucht. Dieser Artikel beschreibt den Nutzen der herausgeschnittenen Blatt Verfahren zur Messung der Raten der Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkraut (waterhemp). Die Menge der Mutter Herbizid verblieben war, zu jedem Zeitpunkt (1) durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Regressionsanalyse Sitz mit einer einfachen ersten Ordnung Kurve, um die Zeit für die 50% der absorbierten Herbizids zu erniedrigen Schätzung (bestimmt und wurde DT _50). RepräsentativChromatogramme von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) für ALS-resistente und -sensitive waterhemp Populationen, die das Verschwinden der Mutter Herbizid und gleichzeitiger Bildung von polaren Metaboliten (s) während einer Zeitverlaufsstudie anzuzeigen (Abbildung angezeigten 2). Der Schwerpunkt unseres Artikels ist zu beschreiben und zeigen die Nützlichkeit des herausgeschnittenen Blatt Assay in Kombination mit einem vegetativen Klonen Methode zur Bestimmung präzise und reproduzierbare Raten von Herbizidmetabolismus in dicot Pflanzen, mit gleichmäßig Ring-markierten (URL- ¹⁴ C) Herbizide in drei waterhemp Populationen, die in ihrer Ganzpflanzenantworten zu unterscheiden HPPD- und ALS-inhibierenden Herbiziden (Tabelle 1).

Protocol

1. Pflanzenmaterial, Wachstumsbedingungen und Vegetative Cloning Hinweis: Drei waterhemp Populationen wurden in dieser Forschung untersucht: MCR (von McLean County, IL), ACR (von Adams County, IL) und WCS (von Wayne County, IL) (Tabelle 1). Sammeln und waterhemp Samen in 0,1 g L -1 Agar auszusetzen: Wasser-Lösung bei 4 ° C für mindestens 30 Tage, um die Keimung zu verbessern. Hinweis: Einige waterhemp Populationen sind ruhend, aber dieser Schritt hil…

Representative Results

Entweder zwischen WCS oder ACR und MCR (Abbildung 1) wurden große Unterschiede in Raten von Mesotrion Stoffwechsel erkannt. Zu jedem Zeitpunkt, hatte MCR Mesotrion schneller als die beiden Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen, WCS und ACR, die mit früheren Ganzpflanzen phänotypische Reaktionen 11 korreliert metabolisiert. Durch Klonen genug Pflanzen aus einer Elternpflanze aus jeder Population, sind herbizid Stoffwechsel Zeitverlauf Analysen gleichmäßige und reproduzierbare aufgru…

Discussion

Die hier beschriebene geschnitten Blatt-Verfahren wurde bereits in der Erforschung Primisulfuron Stoffwechsel in Maisblätter ¹⁵ verwendet worden, aber unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll ist auch wirkungsvoll, präzise und reproduzierbar zu messen Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkrautarten ^12. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik gegenüber Ganzpflanzen Studien ist, dass ein ausgeschnittener Blatt ist unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster Nachauflauf, sy…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	A1296	for pre-germinating seeds
Potting medium	Sun Gro Horticulture	49040233	for plant growth
Nutricote	Agrivert	TOTAL BLEND 13-13-13 T100	slow-release fertilizer
Growth chamber E15	Controlled Environments Limited	20207	plant culturing
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500	buffer for excised leaves
HCl (concentrated)	Fisher Scientific	A144500	adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts	Sigma-Aldrich	M0404	incubation of excised leaves
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	leaf washes after incubation
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade)	Macron Fine Chemicals	MKH07610	HPLC mobile phase
Formic acid	Mallinckrodt Analytical	MK259205	acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge	Eppendorf	5417R	1.5 or 2.0 mL tubes
Centrifuge (temperature controlled)	Eppendorf	5810R	15 or 50 mL tubes
Polypropylene centrifuge tube	Corning Inc.	430790	15 mL, sterile
Rotary evaporator	BÜCHI	R200	concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS)	Packard Instruments	104470	quantify 14C
High-performance liquid chromatography	Perkin Elmer	N2910401	resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer	LabLogic System	1103303	for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column	Thermo-Scientific	03-050-522	reversed phase
Ultima-Flo M cocktail	Perkin Elmer	6013579	for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)	Fisher Scientific	SX18	for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer	Kinematica	CH-6010	homogenize leaf samples