Mesurer les taux de métabolisme dans l'herbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
La résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes présente une grave menace pour la production mondiale de nourriture et de fibres 1,2. Actuellement, des milliers de populations résistantes et de biotypes de plus d'une centaine espèces de mauvaises herbes dans le monde entier ont été documentés et étudiés 3. Un mécanisme majeur qui confère une résistance aux herbicides dans des plantes est l'altération herbicide de gènes et de protéines à un site cible, y compris des mutations génétiques qui affectent la cinétique ou l'amplification du gène de site de liaison cible herbicide 2-protéine. Désintoxication métabolique grâce à des activités élevées de la cytochrome P450 monooxygénase (P450) ou le glutathion S -transferase (TPS) enzymes est un autre mécanisme qui confère une résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes, qui est distinct de plusieurs façons de mécanismes fondés sur-site cible 2. La résistance en fonction métabolique a des ramifications importantes pour savoir si les coûts de remise en forme de la plante (aka pénalités de remise en forme) peuvent entraîner des mechanis résistance aux herbicidesm, ainsi que sur le potentiel d'un mécanisme unique de désintoxication pour conférer une résistance croisée ou plusieurs herbicides dans les populations de mauvaises herbes 1,2,4. En général, le métabolisme de l'herbicide dans les plantes peut être divisé en trois phases distinctes 5. Phase I implique la conversion d'herbicide ou d'activation tel que P450 hydroxylation de noyaux aromatiques ou des groupes alkyle, ou par N – réactions de désalkylation ou o-, ce qui augmente la polarité et de l'herbicide 5,6 partiel désintoxication. Nouvellement introduit des groupes fonctionnels dans la Phase I peuvent fournir des sites de liaison pour la conjugaison au glutathion réduit par GST ou en glucose par glycosyltransférases dépendants UDP dans la phase II de 5,7. Par exemple, le principal métabolite initial de primisulfuron-méthyle dans le maïs est un groupe hydroxy-primisulfuron-méthyl 8, qui peut être métabolisé en hydroxy-primisulfuron-glucoside (Phase II) et ensuite transporté vers la vacuole pour le stockage à long terme ou encore métabolique pro5,6 transformation (phase III).
Tuberculée (Amaranthus tuberculatus) est une tâche difficile à contrôler, les espèces de dicotylédones annuelles de mauvaises herbes qui entrave la production de maïs (Zea mays), le soja (Glycine max) et le coton (Gossypium hirsutum) aux États-Unis. Le degré élevé de diversité génétique des tuberculée est facilitée par sa biologie dioïque et longue distance pollinisation par le vent, et un plant femelle unique tuberculée peut produire jusqu'à un million de graines 9. Ces graines sont petites et se propager facilement, qui lui confèrent naturellement tuberculée avec un mécanisme de dispersion efficace. Tuberculée affiche la germination continue tout au long de la saison de croissance 9, et ses graines sont capables de germer après plusieurs années d'inactivité. Tuberculée est une plante C 4 qui possède un taux de croissance plus élevé que la plupart des mauvaises herbes à feuilles larges dans les systèmes de culture arables 10. En outre, de nombreuses populations de tuberculée sont résistants à la fam multiplesilles d'herbicides 3.
Une population de tuberculée (désigné MCR) de l'Illinois est résistant à la 4-hydroxy-phénylpyruvate dioxygénase (HPPD) herbicides inhibant 11, tels que la mésotrione, ainsi que pour l'atrazine et acétolactate synthase (ALS) herbicides inhibant, y compris primisulfuron-méthyl , en raison de la non-cible site mécanismes fondés 12,13. Une population différente de tuberculée désigné ACR 14, qui est résistant primisulfuron-méthyl-(en raison d'une mutation dans le gène ALS) et de l'atrazine résistantes mais sensibles à la mésotrione, et une population de tuberculée désigné WCS 14 qui est sensible au primisulfuron-méthyle, mésotrione, et l'atrazine ont été utilisés en comparaison avec MCR dans notre recherche avant 12 et les expériences en cours (résumés dans le tableau 1). Des études initiales ne pas détecter des altérations dans les niveaux de la séquence de gène de l'HPPD ou d'expression, ou l'absorption de la mésotrione réduit, dans le MCRpopulation par rapport aux populations de mésotrione sensible 12. Cependant, les études de métabolisme avec des plantes entières ont démontré des niveaux significativement plus faibles de l'herbicide parent de mésotrione dans MCR par rapport à l'ACR et le WCS, qui en corrélation avec les réponses phénotypiques précédentes pour mésotrione 11,12.
| Tuberculée population | Abréviation | Phénotype à Mésotrione | Mécanisme Résistance Mésotrione | Phénotype de Primisulfuron | Mécanisme Résistance Primisulfuron |
| Comté de McLean-résistant | MCR | Résistant | Métabolisme * | Résistant | Métabolisme |
| Adams County résistant | ACR | Sensitive | – | Résistant | Mutation cible place dans la SLA 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Sensible | – | Sensible | – |
* Mécanismes de résistance non-target-site, autres que métabolisme accru, peuvent également conférer à la population MCR 12 résistance à la mésotrione.
Tableau 1: description des populations de tuberculée de Illinois utilisés dans cette étude.
En plus de déterminer les taux de métabolisme de l'herbicide dans les semis de tuberculée intactes, une approche expérimentale différente a été développée et utilisée dans notre étude précédente pour étudier le métabolisme en utilisant un tuberculée test sur feuilles excisées 12 ainsi que divers inhibiteurs du cytochrome P450 (par exemple, tetcyclacis et malathion). Cette méthode a été adaptée spécifiquement pour tuberculée d'un PREVIous enquête du métabolisme du primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse 15, depuis le test de la feuille excisée n'a pas encore été signalé pour mener des recherches sur le métabolisme de l'herbicide dans une usine de dicotylédones. L'insecticide malathion organophophosate a été fréquemment utilisé pour in vivo et dans la recherche herbicides métabolisme in vitro pour indiquer la participation de 16 P450. Par exemple, la tolérance et le métabolisme rapide de la mésotrione dans le maïs sont dues à P450 catalysée par hydroxylation de l'anneau, qui a été vérifiée lorsque le malathion sensibilité accrue du maïs pour la mésotrione 17. De même, le malathion a inhibé le métabolisme de l'Inhibiteur de l'ALS primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse 15. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée est que les données générées sont indépendantes de motifs de translocation de plantes entières, un facteur important à considérer lors de l'évaluation du métabolisme systémique, herbicides de postlevée dans les plantes. En conséquence, cette méthode permet quantitative etanalyse métabolique qualitative de se concentrer sur une seule feuille traitée 12.
Une stratégie de clonage végétative, en combinaison avec le protocole de la feuille excisée, a déjà été utilisé dans tuberculée de mener des études sur le métabolisme 12. En raison de la nature de la pollinisation croisée tuberculée (séparés pour les hommes et les plantes femelles), et un grand degré de diversité génétique au sein des espèces d'Amaranthus dioïque 9, ce protocole a assuré que les semis de tuberculée génétiquement identiques ont été analysés dans les expériences de temps bien sûr. Cet article démontre l'utilité de la méthode de la feuille excisée pour mesurer les taux de métabolisme de l'herbicide dans une mauvaise herbe dicotylédone (de tuberculée). La quantité d'herbicide parent restant a été déterminée à chaque point (figure 1) de temps en moins l'analyse des carrés de régression non linéaire, et a été en forme avec une courbe simple de premier ordre afin d'estimer le temps pour 50% d'herbicide absorbé à se dégrader ( DT 50). Représentantchromatogrammes de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) sont affichés pour la SLA-résistants et les populations de tuberculée -sensibles, qui indiquent la disparition de l'herbicide mère et la formation concomitante de métabolite (s) polaire à une étude des temps bien sûr (Figure 2). L'objectif de notre article est de décrire et de démontrer l'utilité de l'analyse de la feuille excisée en combinaison avec une méthode de clonage végétal pour déterminer les taux précis et reproductibles du métabolisme des herbicides dans les plantes dicotylédones, en utilisant uniformément anneau marqué (URL- 14 C) herbicides trois populations de tuberculée qui diffèrent dans leurs réponses de plantes entières à HPPD- et herbicides inhibant l'ALS (tableau 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode excisé feuilles décrit ici a déjà été utilisé dans la recherche métabolisme primisulfuron en feuilles de maïs 15, mais nos résultats démontrent que ce protocole est également efficace, précis et reproductible pour mesurer le métabolisme de l'herbicide dans une espèce de mauvaises herbes dicotylédones 12. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée par rapport aux études plante entière qui est une feuille excisée est indépendante de motifs de translo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
Referências
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