βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
βバレルのOMPは、ミトコンドリア、葉緑体、およびグラム陰性菌1-3の外膜で見つけることができます。彼らはαヘリックスタンパク質と同様の役割を果たしているが、彼らはそれぞれの鎖が密接に隣接する二つの鎖に接続されて8月26日、反平行のβ鎖に至るまで中央の膜に埋め込まれたβバレルドメインからなる非常に異なる倍を持っています（ 図1及び2）。 βバレルドメインの最初と最後のストランドは、その後、周囲の膜からβバレルドメインを閉じて密封するために、（ミトコンドリアVDACを除く）反平行にほぼ独占的に、互いに相互作用します。すべてのβバレルのOMPは、これらのループは、時々そのようなプロ結合ナイセリアトランスフェリンにおいて見出されるような75残基と同じ大きさで、リガンド相互作用および/またはタンパク質 – タンパク質接触に重要な役割を果たして変化配列および長さの細胞外ループを有しますテインA（のTbpA）4。 βバレルのOMPは、タンパク質の機能的な目的（ 例えば、バマ5-7、FimD 8,9、ファドル10）のような追加のドメインを果たすN末端 またはC末端ペリプラズム拡張機能をも持つことができます。 βバレルのOMPの多くの種類が11存在するが、より一般的なタイプの2は、フィールド、（1）TonB依存トランスポーター及び（2）オートトランスポーターとあまり慣れているため、例として、以下に記載されています。
TonB依存トランスポーター（ 例えば、FEPA、のTbpA、のbtuB、Cirの、 など ） は 、栄養のインポートのために不可欠であり、C末端の22本鎖β-内側に隠れて発見された〜150残基からなるN末端 プラグドメインを含みますバレルドメインは、外膜12（ 図3）の中に埋め込 まれました。このプラグインのドメインを自由にバレルドメインを通過する基板を防ぎながら、基質結合は、プラグドメイン番目の内のコンホメーション変化を誘導しますリードで（プラグ転位によって、またはプラグの部分的/完全な排出のいずれかによって）、その後ペリプラズムに外膜を横切って基板搬送を容易にすることができる形成を細孔します。 TonB依存のトランスポーターは、直接ヒト宿主タンパク質4,13,14から鉄などの栄養素をハイジャック特殊なトランスポーターを進化させてきたような髄膜炎菌などのグラム陰性菌のいくつかの病原性株の生存のために特に重要です。
オートトランスポーターは、グラム陰性菌のV型分泌系に属し、βバレルドメインからなるβバレルのOMP（ESTA及びESPPと同様に、通常、12ストランド）とで分泌または提示されているいずれかのパッセンジャードメインですセル15,16（ 図3）の表面。これらのβバレルのOMPは、多くの場合、サービングパッセンジャードメインと細胞の生存と病原性において重要な役割を果たしいずれかのプロテアーゼ、付着、および/または他のEFなどfectorそれは病因を媒介します。
このようなX線結晶学、NMR分光法、および電子顕微鏡（EM）、私たちは順番に、それらは、外膜内で機能する方法を正確に解読するために使用することができ、原子分解能でのOMPのためのモデルを決定することを可能にするような構造の方法。該当する場合は、この貴重な情報は、薬物およびワクチンの開発のために使用することができます。例えば、トランスフェリン結合タンパク質A（のTbpA）はナイセリアの表面上に見出され、それが直接ヒトトランスフェリンを結合し、その後抽出し、自身の生存のために鉄をインポートするため、病原性のために必要とされます。 TbpAがなければ、 ナイセリアはヒト宿主から鉄を除去することができず、非病原性にされます。 TbpA 4に結合したヒトトランスフェリンの結晶構造が解明された後、それは2つのタンパク質が関連するどのくらい鮮明になった、のTbpAのどの領域が相互作用を媒介、のTbpAによって鉄抽出のための重要な何であったか残基、およびどのように1はのTbpAを標的ナイセリアに対する治療薬を開発する可能性があります。したがって、生存と病原性グラム陰性細菌中のβバレルのOMPの重要性を与えられただけでなく、ミトコンドリアと葉緑体機能、および追加の構造膜タンパク質のこのユニークなクラスに関する情報とそれらが機能するシステムの必要性、一般的なプロトコルは、構造的な方法によって特徴づけのために高レベルでターゲットのOMPを発現させ、精製の全体的な目標が提示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
βバレルのOMPは、グラム陰性菌、ミトコンドリアと葉緑体中で重要な役割を果たし、これらのそれぞれの細胞小器官の外膜に不可欠な分子メカニズムに関する豊富な情報を提供する構造解析のための重要な標的です。しかし、構造分析のための十分なサンプルを生成することは必ずしも簡単ではないので、一般的なパイプラインを詳細に結晶に構築物からの処理を説明するための、構造決意?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
Referências
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