Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Summary

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Abstract

As células estaminais neurais (NCCC) na zona subventricular dos ventrículos laterais (SVZ) sustentar neurogénese olfactiva durante toda a vida no cérebro de mamíferos. Eles geram sucessivamente células de trânsito amplificando (TAC) e neuroblasts que se diferenciam em neurônios, uma vez que integram os bulbos olfatórios. Emergindo de células activadas fluorescentes (FACS) técnicas permitiram o isolamento de NSCs, bem como seus descendentes e já começaram a lançar luz sobre redes de regulação de genes em nichos neurogênicos adultos. Descrevemos aqui uma separação de células técnica que permite distinguir a seguir e a dinâmica do ciclo celular das populações de células acima mencionados a partir do SVZ adulto com uma lex / EGFR / CD24 coloração tripla. Células isoladas são então banhado como células aderentes para explorar em detalhes a sua progressão do ciclo celular por microscopia de lapso de tempo vídeo. Para este fim, usamos transgénico indicador do ciclo celular de fluorescência Ubiquinação (FUCCI) ratinhos em que as células são vermelho fluorescente durang _G 1 fase devido a uma _G 1 específico repórter vermelho-CDT1. Este método revelou recentemente que NSC proliferação alongar progressivamente a sua fase _G 1 durante o envelhecimento, levando a prejuízo neurogênese. Este método é facilmente transponível para outros sistemas e poderiam ser de grande interesse para o estudo da dinâmica do ciclo celular de células do cérebro, no contexto de patologias cerebrais.

Introduction

Células-tronco neurais quiescentes (NCCC) são a fonte para a neurogênese adulta ¹ e pode converter em seu proliferativa "ativado" formulário expressando EGFR ^(aNSCs) 2. Uma vez ativado, eles dão origem a células de trânsito amplificando (TAC) ³ e, em seguida neuroblastos que migram para os bulbos olfatórios (OB) através de um tubo de astrócitos e, finalmente, diferenciam em neurônios ^4,5. NSC e sua progênie são organizados em "nichos" especializados arquiteturas ao longo dos ventrículos laterais, implicando uma miríade de fatores que controlam a sua proliferação ^6. O isolamento e purificação de células neurogénicos SVZ é necessário iluminar a regulação molecular do complexo a sua proliferação, mas mantiveram-se um desafio por um longo período de tempo, devido à ausência de marcadores específicos e técnicas adequadas.

Novas abordagens utilizando citometria de fluxo tornaram possível o isolamento de NSCs e their progênie do adulto SVZ ^2,7-11. Usando o marcador de células estaminais LeX ¹² juntamente com neuroblastos marcador CD24 ¹³ e um FEG fluorescência para rotular o EGFR em células em proliferação ^2, que recentemente desenvolveu uma estratégia de FACS permitindo a purificação de cinco dos principais SVZ populações neurogénicos: quiescentes e activados NSC, TAC, imaturos, bem como migrando neuroblasts ^9. Aqui, descrevemos em detalhes esta célula triagem técnica e como uma lex / EGFR / CD24 coloração tripla permitido pela primeira vez o isolamento de ambos os NSCs quiescentes e ativadas.

Embora a neurogênese persistir durante a idade adulta, a produção de novos neurônios diminui drasticamente no envelhecimento cerebral ^14. A maioria dos estudos concordam com uma redução progressiva do número de proliferação de células progenitoras no SGZ e SVZ ^15-20. As conseqüências não são inócuos como o declínio relativo à idade na neurogênese no SVZ provoca uma diminuição de nneurônios ewborn nos bulbos olfatórios do cérebro envelhecido, levando a prejuízo na discriminação olfativa em camundongos ^com idade entre 18. Elucidar cinética do ciclo celular de células progenitoras neurais é um passo fundamental para compreender os mecanismos subjacentes à evolução da neurogênese adulta durante o envelhecimento. Estudos recentes investigaram a do ciclo celular e na progressão linhagem de células estaminais neuronais adultas in vitro ²¹ e in vivo ^{22, mas} nenhum deles teve vantagem de separação de células técnicas e geneticamente codificados sondas do ciclo celular fluorescentes para visualizar as fases do ciclo celular de células isoladas a um nível de uma única célula.

Aqui, descrevemos um protocolo que tira proveito dos ratinhos transgénicos FUCCI em que as células são fluorescentes durante o seu ciclo de célula, permitindo a distinção entre G ₁ e SG ₂ / H ²³ fases. Este protocolo mostra o isolamento como prospectivo de NSC e sua progênie de adulto FUCCI mice combinada com microscopia de lapso de tempo vídeo permite o estudo da dinâmica do ciclo celular em um nível de uma única célula.

Protocol

Este protocolo foi concebido em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias do 24 de novembro de 1986 (86/609 / CEE) e foi aprovado pelo nosso bem-estar animal comitê institucional (CETEA-CEA DSV IDF).

1. Configuração básica Antes de Cultura e Videomicroscopia

1. Utilizar placas de cultura de vidro de fundo ou u-Placas por microscopia confocal de vídeo. Para 1 - 5 x 10 ³ células / poço, utilizar placas de 96 poços e as placas de 24 poços para mais do que 5 x 10 ³ células / poço.
2. Pelo menos um dia antes de se iniciar o experimento, preparar estéril poli-D-lisina (PDL) placas revestidas para culturas em monocamada aderente. Adicionar suficiente PDL (10 ug / ml em dH2O) para revestir o fundo de cada poço e incubar O / N a 37 ° C. Remover a solução de PDL e lavar três vezes com _dH2O antes de permitir que a placa secar ao capuz durante pelo menos 2 horas, sob um fluxo laminar. Se não for utilizado imediatamente, armazenar a placa revestida em-20 ° C.
3. Prepare meio de cultura por mistura NSC Meio Basal e NSC Proliferação suplemento a uma 9: 1 (ver tabela de materiais) juntamente com 2 ug / ml de heparina, 20 ng / fator ml humana purificada de crescimento epidérmico recombinante (EGF), e 10 ng / mL factor de crescimento de fibroblastos recombinante humano 2 (FGF-2). Aquecer o meio de cultura a 37 ° C num banho de água antes da utilização.
4. Para a dissociação SVZ, preparar a solução de papaína: 1 mg / mL de papaína (15 IU / ml) no equilíbrio de sal da solução de Earl (EBSS) contendo 0,2 mg / ml de L-cisteína, 0,2 mg / ml de EDTA e 0,01 mg / ml de DNase I em PBS. Esterilizar a solução por passagem através de um filtro de 0,2 um. Equilibrar a solução a 37 ° C antes da utilização.
5. Para parar a reacção enzimática, preparar uma solução de inibidor de protease (ovomucoide): F12 contendo 0,7 mg / ml de inibidor de tripsina de tipo II: DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 um.
6. Prepare PBS 0,6% solução de glicose para recolher os cérebros e PBS 0,15% BSA sOlution para as etapas de lavagem e para a coloração de anticorpos.
7. Preparar as ferramentas de dissecação: tesoura, dissecando e amarrando fórceps, bisturi. Mergulhe-os em etanol a 70%.

2. A colheita de rato adulto Brains e SVZ microdissecações

1. Sacrifício adulto FUCCI ratos ^{23 (2} a 3 meses de idade e / ou 12 meses de idade, para o envelhecimento estudos) realizar um deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes institucionais adequadas.
2. Pulverizar o mouse usando 70% de etanol e cortar a cabeça usando uma tesoura afiada.
3. Realizar uma incisão ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio.
4. Realizar um corte longitudinal mediana começando na base do crânio para os bulbos olfatórios usando um pequeno par de tesouras. Certifique-se de não danificar o cérebro subjacente com as lâminas da tesoura. Remova a parte superior aberta do crânio com uma pinça curva para expor o cérebro.
5. Recolhe-se o cérebro em uma placa de Petri 15 mm contendo 0,6% de glucose em PBS.
6. Dissect afastado os bulbos olfatórios. Coloque o cérebro em sua superfície dorsal e fazer uma secção coronal através do quiasma utilizando um bisturi.
7. Sob um microscópio de dissecação, posicione a parte rostral da seção do cérebro com a superfície coronal corte virado para cima em direção ao experimentador.
8. Para dissecar o SVZ, remover o septo com uma pinça fina curvas em seguida, insira uma ponta de uma pinça fina para o corpo estriado imediatamente adjacente ao ventrículo e retire o SVZ do tecido circundante. Para obter detalhes adicionais, consulte Azari et al. ^24. Coloque a SVZ dissecado em uma placa de Petri contendo 1 ml de PBS-0,6% de glucose.

3. SVZ dissociação Tissue

1. Picar o SVZ dissecado na placa de Petri até que não haja grandes pedaços permanecem.
2. Transferir o tecido moído, juntamente com a% de glucose PBS-0,6 a um tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
3. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de papaína pré-aquecido (1mg / ml, preparado no passo 1.4) suplementado com 0,01 mg / ml de DNase I. incubar durante 10 min num banho de água a 37 ° C. Use 1 mL de papaína por mouse.
4. Centrifugar a 200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
5. Adicionar 1 ml de pré-aquecido ovomucóide (0,7 mg / ml, preparado no passo 1.5) para parar a actividade de papaina. Mecanicamente dissociar o tecido picada ainda mais em uma suspensão de uma única célula cuidado pipetando para cima e para baixo 20 vezes por meio de uma ponta P1000 micropipeta. Evitar bolhas de ar.
6. Passar a suspensão de células através de um filtro estéril de 20 um de um novo tubo de 15 ml. Certifique-se de lavar o filtro de células com PBS 0,15% BSA para evitar a perda de células.
7. Centrifugar a 200 xg durante 10 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender as células em 100 ul de PBS contendo 0,15% de BSA.

4. coloração de imunofluorescência para classificação celular

Para separação de células usando FUCCI-Red ratos (Figura 2A), use o seguinteanticorpos: CD24 ficoeritrina-cyanine7 conjugadas [PC7]; CD15 / LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] conjugado e conjugado de ligando de EGF Ax647.

Nota: células LeX ⁺ EGFR ⁺ e células EGFR ⁺ não são abundantes na SVZ adulto: ≈ 600 e 1500 células / rato, respectivamente ^9. Recomendamos pooling células SVZ de 2 a 3 ratos para ter material suficiente. Não trabalhe com mais de 12 ratos no mesmo dia, de modo que a duração de triagem de células não exceda 3 hr. Tenha em atenção que o trabalho com muitos ratos no mesmo dia conduzirá a um aumento da duração da separação de células, possivelmente, resultando num aumento da morte celular e / ou diferenciação celular.

1. Realizar a coloração de FACS em 100 ul de PBS, 0,15% de BSA por ratinho (ou em 200 ul de um grupo de 2 a 3 ratos para coloração óptima).
2. Preparar os tubos de controlo. Utilize esferas de compensação para preparar tubos de controle de cores individuais de acordo com o fabricante9; s protocolo. Selecione uma fração de células (1/10 das células extraídas de um ratinho é suficiente) e separá-lo em 4 tubos para preparar um tubo de controle negativo (células não marcadas) e 3 fluorescência menos um (FMO) tubos de controlo. Ressuspender as células em 200 ul de PBS, 0,15% de BSA por tubo.
   Dica: Para o controle LeX-FITC FMO, rotular as células com CD24-PC7 (1:50) e Ax647 conjugado ligando EGF (1: 200); para o controle de CD24-PC7 FMO, rotular as células com CD15 / Lex-FITC (1:50) e Ax647 conjugado ligando EGF (1: 200) e para Ax647 conjugado de controle de FMO EGF ligando, rotular as células com CD15 / LeX- FITC (1:50) e CD24-PC7 (1:50).
3. Para os tubos utilizados para separação de células, use as seguintes anticorpos na diluição indicada em PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15 / Lex-FITC (1:50) e ligando EGF Ax647 conjugada (1: 200).
4. Incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro. Lava-se com 1 ml de PBS 0,15% de BSA e centrifugar a 200 xg durante 10 min. Volte a suspender as células em 20081; l de PBS 0,15% de BSA por cérebro. Mantenha os tubos de separação de células em gelo e proceder de imediato à separação de células.
5. Se utilizando camundongos FUCCI-Verde, frações LeX-positivos e negativos LeX separados usando colunas de separação antes de separação de células como as ações de anticorpos LeX-FITC o mesmo comprimento de onda de emissão de fluorescência FUCCI-verde (Figura 3A, B).
   1. Em primeiro lugar, marcar as células com um anticorpo de ratinho anti-humano LEX-anticorpo (1:50) durante 15 minutos a 4 ° C no escuro em 100 ul de PBS, 0,15% de BSA.
   2. Lavam-se as células com 1 ml de PBS 0,15% de BSA e centrifugar a 200 xg durante 10 min, em seguida, marcar as células com microesferas de IgM anti-ratinho (1:10) durante 15 minutos a 4 ° C no escuro.
   3. Lavam-se as células com 1 ml de PBS 0,15% de BSA e centrifugar a 200 xg durante 10 min. Ressuspender as células em 500 ul de PBS 0,15% de BSA e despeje as células através de uma coluna de separação no campo magnético, como esquematizado na Figura 3 C. Lavou-se a coluna com 1 ml de PBS 0,15% de BSA para obter fração negativa LeX.
   4. Para se obter a fracção LEX-positiva, remover a coluna de separação a partir do campo magnético e eluir as células com 2 ml de PBS 0,15% de BSA.
   5. Avance para o CD24-PC7 e Ax647 conjugado coloração EGF ligante, tal como indicado no ponto 4.2.

5. celular Seleção

Nota: As células foram classificadas em um classificador FACS a 40 psi com uma 86 mm noozle. Fluorescência foram obtidos utilizando o seguinte conjunto de filtros: 520 / 35nm (ITCF), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) e 740LP (PC7). A compensação é necessária para evitar sinais de falso-positivos como é encontrada uma sobreposição entre os espectros de emissão de fluorescência FUCCI-vermelho e do corante PC7.

1. Imediatamente antes da separação de células, adicionar um corante vital para discriminar ao vivo a partir de células mortas. Usamos HO (ver tabela de materiais) na proporção de 2 ug / ml de concentração final. Execute o tubo de controle negativo (células não marcadas), através do classificador FACS e selecione thcélulas e usando dispersão para a frente (FSC) parâmetros (Figura 1A) dispersão lateral (SSC) e.
   NOTA: As células mortas foram excluídos por gating apenas a fracção HO-negativo (Figura 1A) e, em seguida, doublets foram excluídos selecionando a largura de pulso fração negativa (Figura 1A '').
2. Execute os controles de cor individuais preparadas no passo 4.2 e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT) tensões (escala de células ou seja população negativa muito alta e / ou positivos off), se necessário. Execute a compensação de cor na janela de compensação do software.
3. Run FMO controla preparada no passo 4.2 (controle FMO LeX-FITC, CD24-PC7 controle FMO e Ax647 conjugado controle FMO EGF ligante) e desenhe os portões de classificação (Figura 1). Ordenar as células diretamente em 100 ul de meio de cultura em 1,5 ml microtubos.

6. Preparação das células para microscopia

1. Placa da célula recém-classificadass a uma densidade de 1 - 3 x 10 ³ células / poço de poli-D-lisina- revestido de 96 poços μ placa com 300 ul de meio de cultura.
2. Antes de microscopia de vídeo, incubar as placas de cultura a 37 ° C e _5% de CO2 pelo menos durante 1 hora para permitir a adesão celular.

7. Configuração do microscópio e Aquisição de Imagem

1. Realizar imagem ao vivo utilizando uma objectiva de 20x Plano Apo VC DIC (NA: 0,75) num sistema de microscópio confocal de varrimento laser ligado a uma câmara invertida termostatizada a 37 ° C sob 5% de _atmosfera de CO2.
2. Posicionar a 96 μ bem-placa no interior da câmara termostatizada pré-aquecido e equilibrou-se e substituir a tampa por uma cobertura termostatizada.
3. Abra o software NIS-Elements e clique na barra de menu em "Adquirir / Aquisição controla / aquisição ND" para selecionar as opções do time-lapse (comprimento, posições de palco, confocal z-seções, ...), "Acquire / controles de Aquisição / Pad Ti221; para selecionar os objetivos e "Acquire / controles Aquisições / A1plus Configurações" para selecionar o nível de PMT para cada fluorescência na barra de menu. Selecione uma pasta para guardar os arquivos de dados.
4. Usando a janela de aquisição da ND, situado no centro de cada bem como uma posição de estágio e selecionar a opção de grande imagem para 7 x 7 mm². Isto vai criar uma imagem em mosaico em torno do centro de cada poço. Definir a sobreposição para a grande imagem de mosaico a 5%. Tirar fotos a cada 20 min durante 24 horas. Selecione o objectivo Plano de Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) na janela de Ti Pad.
5. Na janela de configurações A1plus, adquirir imagens de scanner de ressonância usando alta velocidade com um formato de 512 x 512 pixels com uma resolução de 1,26 mm / pixel. Use de campo claro de visualizar formas celulares. No caso de ratinhos FUCCI-vermelhos, excita a fluorescência vermelha em 561 nm e recolher utilizando um filtro 595/50 nm. No caso de ratinhos FUCCI-verde, excita a fluorescência verde a 488 nm e recolher utilizando um filtro 530/40 nm. Determinar a PM idealNível T, offset e potência do laser para cada comprimento de onda.
   NOTA: Recomendamos a utilização da função de focagem automática para o canal brightfield para permitir que o software para a focagem automática em cada posição de estágio antes de cada aquisição. Dica: Um objectivo Plano de Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) foi utilizado para a sua excelente resolução, sem a necessidade de petróleo. Outros objectivos podem ser usadas, dependendo da resolução óptica desejada.
6. Selecione a opção "Executar agora" botão na janela de aquisição do ND para começar a aquisição.
   Dica: Siga o trabalho do computador para um loop para ter certeza de que tudo no funcionando corretamente.

8. Processamento de Imagem e Análise

1. Analisar os dados diretamente no software NIS-Elements, acompanhando as células individualmente. Dica: Para ganhar tempo, economizar cada posição em formato .avi usando o software NIS-Elements e analisar os filmes com ImageJ.
2. No software ImageJ, rastrear células individuais submetidos a, pelo menos, 2 divisões (isto é, uma célula parauma colónia de quatro células). Cortar uma pequena área ao redor da célula e selecione "Imagem / Duplicate '.
3. Selecione 'Imagem / Pilhas / Faça Montage' na barra de menu para fazer uma montagem. Especifique os quadros a serem incluídos, o tamanho das imagens e salvar a montagem como um arquivo .tif para resolução ideal.
4. Para calcular a primeira SG ₂ / M comprimento fase (Figura 2C, D), selecionar uma única célula fluorescente vermelha (em _G 1) e, em seguida, definir t = 0 (fase S começará assim que o vermelho-fluorescência desliga). Contar o número de quadros até que a célula se divide para estimar o comprimento SG ₂ / M.
   NOTA: O tempo calculado depende do intervalo de tempo entre cada quadro.
5. Para calcular a seguinte fase G1 (Figura 2C, D), continuar a acompanhar a célula que apenas dividido. Se a célula entra na fase G1 dividido, haverá uma acumulação de proteína fluorescente vermelha-CDT1. Calcule o número de quadros até vermelho-fluorescência desliga agapor cada célula.
   Sugestão: No início de ₁ L a fluorescência vermelha pode ser tão fraco escolher o início da fase _G1 na armação, onde a célula tem dividido para evitar aproximações.

Results

A capacidade de discriminar de forma confiável entre as diferentes populações de células do rato adulto linhagem de células-tronco SVZ é primordial para investigar suas propriedades funcionais. Para esse efeito, temos desenvolvido uma LeX / EGFR / CD24 estratégia de rotulagem triplo permitindo a purificação de populações específicas de células de SVZ adulto: NSCs repouso (LeX ^brilhantes), NSCs ativados (LeX ⁺ EGFR ^+), TAC (EGFR ⁺⁾ , neuroblastos imaturos e migram (CD24 ⁺ CD24 ^{+ e} EGFR ^+, respectivamente) ⁹ (Figura 1). Aplicado para ratinhos transgénicos FUCCI, a separação de células técnica permite a imagens ao vivo das fases do ciclo celular das diferentes populações neurogénicos ao nível de uma única célula ^25. Camundongos FUCCI-vermelhos foram usados ​​para acompanhar a fase _G 1 com microscopia de fluorescência vermelha usando vídeo time-lapse (Figura 2A). Células ^neg FUCCI-vermelhos representam as células em S-G ₂ / M fases do ciclo celular, as células ^{pos-vermelhos} são FUCCI G ₁ e células ^brilhantes FUCCI-vermelhos são células que saem ou para fora do ciclo celular (Figura 2B) ^{23,26. EGFR} + de células jovens adulto (Figura 2C) e ratinhos de meia idade (Figura 2D) LeX ^{+ + e} EGFR foram plaqueadas como células aderentes nas placas de cultura revestidas com poli-D-lisina. O primeiro SG ₂ / H de fase foi identificada em células individuais uma vez que a fluorescência vermelha desliga-se até que a célula se divide. Como observado anteriormente, o SG ₂ / M comprimento fase não mostrou nenhuma diferença entre as células EGFR ⁺ LeX ^{+ +} e EGFR, tanto em camundongos jovens ou de meia-idade. Em seguida, calculamos a próxima fase _G 1 comprimento da primeira divisão até que a fluorescência vermelha desliga. Curiosamente, uma fase de alongamento L ₁ foi encontrada durante o envelhecimento em células LeX ^{+ EGFR} + mas nãoem células EGFR ^{+ 25} (Figura 2C, D). Em consequência, neuroesferas obtidas 5 dias após o plaqueamento são menores em células ^EGFR + ⁺ LeX obtidos a partir de ratinhos envelhecidos, como mostrado na Figura 2E.

FUCCI-verde ratinhos pode também ser utilizado para visualizar a SG ₂ / H de fase com fluorescência verde (Figura 3A, B), mas as células têm de ser pré-seleccionadas utilizando colunas de separação como anticorpo LEX-FITC partilhavam o mesmo comprimento de onda de emissão do que o FUCCI- fluorescência verde (Figura 3C). Um exemplo de fluorescência FUCCI-verde para o primeiro SG ₂ / H de fase de adulto jovem LeX ⁺ EGFR células ^EGFR + ^{+ e} é mostrado na Figura 3D.

Figura 1:. Estratégia de selecção de células por FACS (A) As células foram em primeiro lugar seleccionados de acordo com tmorfologia herdeiro usando dispersão lateral (SSC) vs dispersão para a frente (FSC) parâmetros. Para mais detalhes sobre a seleção portão morfologia, consulte Daynac et al. ^{9 (a} ') As células mortas foram marcadas usando o marcador HO e excluídos da seleção. (A' ') Parelhas foram excluídos com o parâmetro de largura de pulso. A fim de configurar a triagem portões, fluorescência menos um (FMO) controla para CD24-PC7 (LEX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647 rotulagem; B) e Lex-FITC (FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24 'foram usados) (C, C. B) Em seguida, portões de classificação foram determinados em LeX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24-PC7 tubos rotulados, juntamente com controles FMO; rotulagem -PC7. Os percentuais médios de células totais são representados dentro dos portões. Se selecionar CD24 ⁺ células (neuroblastos), tenha cuidado para excluir as células que expressam CD24 ^brilhantes do portão. Na verdade, CD24 correspondem ^{brilhante para} ce ependymallls ^2,9. C 'representa as células CD24 negativas (quadrado preto no C). Apenas LeX ^{+ EGFR} + e EGFR ⁺ (C ') portões de triagem foram usados ​​para este estudo.

Figura 2: análises ao vivo do ciclo celular usando ratos FUCCI-vermelhos (A) Representação esquemática do ciclo celular FUCCI-Red onde as células são vermelho-fluorescente durante a fase G1 e incolor durante SG ₂ / M fases ^{23 de} representação (B) FACS de.. fluorescência FUCCI-Red em células SVZ. (C, D) microscopia de vídeo com LeX ⁺ EGFR ⁺ e EGFR ⁺ células classificados do jovem (C) e de meia-idade (D) ratos FUCCI-Red permite o acompanhamento da fase _G 1 com Considerando que a fluorescência vermelha SG ₂ / H fases pode ser deduzida when a fluorescência vermelha desliga. Imagens sucessivas são mostrados com uma escala de tempo apresentada em D. (E) Imagens representativas de colónias (neuroesferas) obtido 5 dias após o plaqueamento. Barra de escala:. 10 mm (C, D), 30 um (E) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:.. Estratégia para análises ao vivo do ciclo celular usando ratos FUCCI-verde (A) Representação esquemática do ciclo celular FUCCI-Verde onde as células são verdes durante SG ₂ / M fase e incolor durante _G 1 fase ²³ (B) representação FACS de fluorescência FUCCI-Green: células ^neg FUCCI-verdes representam as células em _fase G1 do ciclo celular enquanto FUCCI-Green células ^pos são células em SG ₂ / M ^23. (C) A fim de seguir o SG verde-fluorescente ₂ / M fases da lex ⁺ EGFR ⁺ e células EGFR ^+, células SVZ teve de ser pré-classificadas com colunas de separação. As células foram marcadas com anticorpo anti-ratinho Lex e fracção LeX ^{+ foi} retido na coluna usando microesferas anti-ratinho (ver protocolo 4.). Então, Lex ⁺ e Lex ^- frações foram eluídas e rotuladas com a EGF-Ax647 e anticorpos CD24-PC7 para separação por FACS (D) microscopia Vídeo de LeX ⁺ EGFR ⁺ e EGFR ⁺ células ordenadas de ratos jovens FUCCI-Green permite o acompanhamento de. O SG ₂ / M fases com fluorescência verde. Imagens sucessivas são mostrados com uma escala de tempo apresentada em D. Barra de escala: 10 ^ M (D).

Discussion

A técnica de separação de células aqui descrito permite a discriminação fiável entre NSCs quiescentes, NSCs ativados e os seus estudos de progênies permitindo às suas propriedades e dinâmicas no cérebro adulto ^9. Juntamente com a tecnologia FUCCI que permite a visualização da progressão do ciclo celular em células vivas ^23, foi desenvolvida uma técnica rápida e eficiente para seguir os L ₁ e SG ₂ / M fases do ciclo celular a partir de células jovens e adultos do cérebro do rato com idade.

A técnica de separação de células utilizadas no presente protocolo foi o primeiro validado combinação de marcadores que permitem a purificação das cinco principais populações neurogénicos do SVZ ^9. Foi também a primeira técnica validada permitindo a distinção de NSCs quiescentes e ativadas. É interessante notar que esta técnica não exige a utilização de ratinhos transgénicos, por si só, o que é necessário quando adaptada para modelos de ratinhos transgénicos such como FUCCI. Desde então, codega et al. ¹⁰ usaram uma combinação marcação tripla GFAP-GFP / CD133 / EGFR para distinguir as NSC quiescentes de sua contraparte activada, mas não podem ser adaptados para a tecnologia FUCCI uma vez que requer a utilização de ratinhos transgénicos GFAP-GFP. Mich et al. ¹¹ desenvolveram um / EGFR CD24 estratégia de rotulagem Glast / triplo que compartilha resultados comuns com a técnica utilizada neste estudo ^9. Na verdade, uma alta correlação entre Lex e marcadores Glast NSCs já foi observada em Daynac et al. ⁹ estudar. No entanto, o anticorpo utilizado Glast na técnica Mich et ai. É acoplado a ficoeritrina e, portanto, não pode ser adaptada com a utilização de ratos FUCCI-vermelhos.

Há vários pontos técnicos importantes que requerem atenção antes de classificar células SVZ. Em primeiro lugar, o passo de dissociação é muito importante como o tecido cerebral tem de ser dissociado em células individuais, embora preservando a estrutura emTegrity das proteínas utilizados para a estratégia de marcação de anticorpos. 0,05% de tripsina-EDTA demonstrou ser muito eficaz na distinção entre tecido SVZ ^{27, mas} o antigénio LeX foi encontrado para ser altamente sensíveis uma vez que quase todos LEX-FITC imunofluorescência foi perdido (dados não mostrados). Assim, papaína foi utilizado como foi mais eficiente e menos destrutiva do que outras proteases no tecido cerebral. Além disso, nem LeX nem EGFR nem CD24 foram afetados pelo tratamento papaína. Deve-se notar que a marcação com anticorpos foi alterada se o tratamento com papaína excedeu 15 min. Nós obtivemos ótimos resultados com um tratamento de papaína 10 min associada a uma dissociação mecânica (pipeta cima e para baixo 20 vezes).

O revestimento com poli-D-lisina permite a cultura de células aderentes e a formação de colónias após vários dias em cultura. É agora amplamente aceito que em ensaios in vitro vem com suas limitações ^28,29. Recomendamos que determinam apenas o primeiro ciclo celular paraas células submetidas a pelo menos uma subsequente divisão para permanecer tão próximo quanto possível para o fenótipo da célula in vivo.

É importante mencionar que as proteínas geminin (fluorescência verde) e CDT1 (fluorescência vermelha) usado para projetar o sistema FUCCI ²³ foram previamente mostrado para ser abundantemente expresso por progenitores neurais durante a neurogênese no início de ratos ^{30 e} no cérebro adulto tecidos ^9,25 . Embora o mKO2-hCdt1 (30/120) constructo foi usado, principalmente, no presente estudo a acompanhar a fase G1 com fluorescência vermelha, o uso de ambas as construções [mKO2-hCdt1 (30/120) e MAG-hGem (1/110) ] poderia ser prevista para permitir a visualização das fases principais do ciclo celular (L ₁ e SG ₂ / H), bem como a _G 1 / S de transição ^23. A principal desvantagem da imagem de dupla-cor é os conjuntos compatíveis limitadas de fluorescência que ainda podem ser utilizados para a rotulagem de células. Uma solução é a utilização de separatiem colunas. Por exemplo, temos esgotado com sucesso a fracção CD24-positivas a partir de células usando colunas de separação antes de separação de células e live-imagiologia como foi utilizado um anticorpo CD24-PE que compartilhavam o mesmo comprimento de onda de emissão de fluorescência FUCCI-Red ^25.

Poucos estudos têm investigado a duração do ciclo celular das populações rato SVZ adultos. O comprimento total do ciclo celular obtidas com a nossa técnica é próxima da estimativa in vitro por Costa et al. ^21, mas não foi capaz, pela primeira vez para distinguir as diferentes fases do ciclo celular. Num estudo in vivo, Ponti et al. ²² usado a incorporação de análogos da timidina para determinar a dinâmica de proliferação das diferentes populações de células de SVZ. No entanto, não podiam realizar uma monitorização contínua do ciclo celular nem rastrear as células ao nível de uma única célula. Este poderia ser um problema, uma vez que foi demonstrado que uma forte heterogeneidade existe sagacidadehin uma determinada população de células SVZ ^22,25. Nós descrevemos aqui uma alternativa técnica in vitro, fácil de configurar, que permite a imagens ao vivo das fases do ciclo celular de diferentes populações adultas neurogênicas em um nível de uma única célula.

Entendendo a regulação do ciclo celular de células-tronco neurais e progenitores continua sendo um desafio para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas no contexto do envelhecimento do cérebro ou patologias. Nosso protocolo pode, assim, ter uma ampla gama de aplicações. No contexto do envelhecimento, essa técnica também poderia ser útil para compreender os efeitos do envelhecimento sobre a diferenciação NSC. De fato, é possível identificar células-tronco / progenitoras neurais que entram diferenciação como a sua intensidade de fluorescência vermelha é distintamente mais elevada ^26. Finalmente, pode também ser de interesse para explorar a imagem ao vivo contínuo a um nível de uma única célula para estudar processos celulares a intrínsecos e extrínsecos responsáveis ​​pela linhagem próprogressão de NSCs adultas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de cultura de fundo de vidro não revestido de 96 poços	MatTek Corp.	P96G-1.5-5-F
µ-Placas de 96 poços	Ibidi	89626
Poli-D-Lisina	Millipore	A003E
NeuroCult NSC Basal Medium	STEMCELL Technologies	5700
NeuroCult NSC Suplemento de Proliferação	STEMCELL Technologies	5701
Heparina	STEMCELL Technologies	7980
EGF	Millipore	GF144
FGF-2	Millipore	GF003
Papain	Worthington	LS003119
EBSS	Invitrogen	24010-043
L-cisteína	Sigma	C-7352
0.5M EDTA, pH 8.0	Promega	V4231
DNase I	Sigma	D5025-15KU
Tipo de inibidor de tripsina II	Sigma	T9128	Ovomucoid
DMEM: F12 médio	Life Technologies	31330-038
20 µ Filtro M	BD Medimachine Filcon	340622
Eppendorf microtubos 3810X	Sigma	Z606340-1000EA
BSA	Sigma	A1595	Solução de albumina de soro bovino
CD24 conjugado ficoeritrina-cianina7 [PC7]	Life Technologies	A14776	Mouse IgM; clone MMA. 1:50
CD15/LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] - conjugado	BD Biosciences	332778	Rato IgG2b; clone M1/69.  1:50
Camundongo anti-humano LeX anticorpo	BD Pharmingen	559045	Camundongo IgM; clone MAM.  1:50
Alexa647 - ligante EGF conjugado	Life Technologies	E35351	1:200; Ligante EGF conjugado com Ax647 no texto
CompBeads	BD Biosciences	644204
colunas de separação MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	(no manuscrito)
Microesferas IgM anti-rato	Miltenyi Biotec	130-047-301
Hoechst 33258	Sigma	861405	HO (no manuscrito)
Classificador de células INFLUX	BD Biosciences		Classificador FACS (no texto)
Sistema de microscópio confocal de varredura a laser Nikon A1R conectado a um ECLIPSE Ti invertido	Nikon Corp.		microscópio confocal de varredura a laser (no manuscrito)
NIS-Elements AR.4.13.01 software de 64 bits	Nikon Corp.		Software NIS-Elements (no manuscrito)
Objetiva Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75)	Nikon Corp.
Câmara termostatizada ECLIPSE Ti	Nikon Corp.		câmara termostatizada (no manuscrito)
ImageJ	RBS
FlowJo	Tree Star, Ashland, OU
camundongos FUCCI	RIKEN BioResource Center, JAPÃO		Sakaue-Sawano et al. 2008