En comparant l'affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

Summary

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Abstract

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

Introduction

The actin cytoskeleton that determines the shape, polarity and migratory properties of mammalian cells is regulated by the Rho-family of small GTPases. The Rho-family GTPases include RhoA that stimulates cytoskeletal contraction, Rac1 that stimulates actin branching and membrane protrusion, and Cdc42 that has similar effects on actin polymerization to Rac1 and causes the formation of filopodia ^1,2. GTPase signaling activity is determined by binding of a nucleotide, which controls the contraction and relaxation of the switch I and switch II loops that mediate the protein-protein interactions with both regulators and effectors. Guanosine 5’-triphosphate (GTP)-bound GTPases activate downstream effectors, whereas the Guanosine 5’-diphosphate (GDP)-bound form is inactive. In the cell, cycles of GTP hydrolysis and nucleotide exchange allow rapid turnover of GTPase signals that are necessary for cytoskeletal dynamics. Nucleotide turnover is regulated by three mechanisms. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stabilize the nucleotide-free GTPase, catalyzing exchange of GDP for GTP, and thereby stimulating GTPase signaling activity ^3,4. GTPase-activating proteins (GAPs) catalyze hydrolysis of GTP to GDP, thereby inhibiting GTPase signaling activity ⁵. Sequestering molecules such as regulator of chromatin condensation 2 (RCC2) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) obscure the switch loops and in the case of GDIs remove the GTPase from the membrane by interaction with the prenyl tail ^6,7. Each of the three classes of regulatory molecule interact with the switch loops, as do the downstream effectors and some trafficking regulators such as coronin-1C ⁷. The purpose of this protocol is to measure competition for the switch I/II binding site between putative regulators and downstream signaling molecules. It should be noted that competition assays test binding to a shared binding site, so that this protocol is not suitable for testing interactions with other sites, such as binding of GDIs to the prenyl tail.

The subtlety of the conformation differences between active and inactive forms, combined with the labile nature of the bound nucleotide, has made study of GTPase-binding events difficult. The role of the bound nucleotide means that conventional binding assays such as immunoprecipitation or surface plasmon resonance are not well suited to investigation, as the nucleotide cannot be controlled. This obstacle is compounded by the overlap in the binding sites of GEFs, GAPs, effectors, sequestering molecules and trafficking molecules, which make binding data for a single interaction difficult to interpret in the context of the competition that will occur in the cell. Immunoprecipitation, in particular, is compromised by competition between binding partners, as under certain cellular conditions, one binding partner might be identified at the expense of all others, while under other conditions, another partner might dominate. The dynamic nature of GTPase signaling is essential to GTPase function and must be considered when analyzing the relationships between the binding interactions of different regulators. Indeed, we recently described a pathway that relied heavily on competitive binding. We identified coronin-1C as a trafficking molecule that bound to the switch loops of GDP-Rac1 ⁷. In areas of low GEF activity, trafficking would dominate, removing Rac1 from those regions. However, when Rac1 is delivered to regions of the cell where GEF activity is high, the GEF would outcompete coronin-1C, thereby both activating Rac1 and preventing coronin-1C-mediated removal of Rac1 from that area. The model goes further, because the action of the GEF exchanges bound GDP for GTP, shifting the equilibrium still further from coronin-1C. Consequently, Rac1 activity could be explained entirely in terms of competition and relative affinity.

In this protocol, we describe a method for comparing the relative affinities of different binding partners for small GTPases, using Rac1 as an example. By using a purified protein approach, it is possible to piece together a chain of signaling events by pair wise comparison, in an experiment where the bound nucleotide can be closely controlled.

Protocol

1. Purification de GTPase de la TPS-étiqueté Culture un E. coli comme BL21 transformées par pGEX-Rac1 O / N à 37 ° C, en agitant à 220 rpm, dans 500 ml de milieu de autoinduction (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM de Na 2 SO 4, MgSO 4 2 mM, CaCl2 2 mM, 0,5% de glycerol, 0,05% de glucose, 0,2% de lactose, 5 g de tryptone, 2,5 g d'extrait de levure, 100 pg / ml d'ampicilline). Récolte de bactéries par centrifugation pendant 10 min à 10 000 xg, 4 ° C. Remettre en suspension culot bactérien dans 20 ml de réactif d'extraction de protéine, inhibiteur de la protéase 1x et incuber pendant 20 min à température ambiante avec inversion. Clarifier le lysat par centrifugation à 40 000 g pendant 30 min. Ajouter 2 ml de billes magnétiques de glutathion, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS: 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM). Incuber pendant 2 h, le mélange par inversion à 4 ° C. Laver les billes de protéine chargée par quatre fois avec 10 ml de PBS, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape. Billes dans deux ml de PBS et les remettre en suspension la protéine magasin chargé à -80 ° C dans 100 ul de parties aliquotes jusqu'à utilisation. 2. Expression de protéines de liaison à GTPase La veille de l'expérience, des plasmides transfecter codant la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged versions de chaque protéine GTPase-contraignant dans un 75-cm 2 ballon séparé de HEK293T comme suit. Pour la validation des nucléotides chargement, transfect GFP-tagged TrioD1 dans un troisième de 75 cm 2 flacon de HEK293T. Diluer polyethylamine à 1 mg / ml dans 100 ul de NaCl 150 mM stérile. Ajouter 27 ul polyethylamine diluée à 223 ul réduits médias sériques. Ajouter ADN plasmidique de 12 ug à 250 pi réduits médias sériques. Incuber chaque tube pendant 2 minutes à température ambiante. </li> Combinez le polyethylamine et l'ADN se mêle dans un seul tube et vortex pendant 2 min. Incuber pendant 15-20 min à température ambiante. Remplacez le support de croissance (milieu Eagle modifié Dulbecco, 10% de sérum fœtal bovin, 2 mM de L-glutamine, pas d'antibiotiques) sur 90% de confluence HEK293T avec 5 ml de milieu de croissance frais. Ajouter le mélange combiné polyethylamine / ADN à incuber la fiole et O / N à 37 ° C, 5% CO 2. 3. Purification des protéines de liaison à GTPase Rincer flacons de cellules transfectées dans du PBS et égoutter flacon pendant 5 minutes, aspirer le liquide libre. Racler les cellules dans 500 ul de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% de Nonidet P-40, 1x inhibiteur de protease) en tube de microcentrifugation. Lyse des cellules par mélange par inversion à 4 ° C pendant 30 min. Au cours de lyse, laver deux lots de 40 ul perles GFP-Trap trois fois avec le tampon de lyse frais, perles sédimentation à 2700 g pendant 2 min entre les lavages. Clarifier les lysats par centrifugation à 21 000 xg pendant 10 min. Transfert précisé lysat de chacune des protéines de concurrents pour séparer les perles lavées GFP-trap et permettent protéines GFP-fusion pour lier pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C. Gardez lysat de cellules GFP-TrioD1 sur la glace. Laver chargés perles GFP-Trap deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de NaCl, 0,7% (p / v) Nonidet P-40 et deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 2 , sédimentation perles à 2700 g pendant 2 min entre les lavages. Éluer les protéines de fusion GFP-40 ul en ajoutant 0,2 M de glycine (pH 2,5) et aspiration et refoulement pendant 30 sec. Immédiatement perles sédiments à 21 000 g pendant 60 s et le liquide de transfert à un nouveau tube de centrifugeuse contenant 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Le faire rapidement pour limiter les dommages à la protéine purifiée. Analyser 1 pi de chaque protéine purifiée par Western blot et la sonde avec un anticorps anti-GFP pour déterminer le rendement relatif en utilisant un Blott quantitativeing système selon le protocole du fabricant. En variante, la détermination des concentrations de protéines par l'acide (BCA) bicinchoninique dosage mais cela introduit des erreurs si les protéines ne réagissent pas avec le dosage d'une manière identique ou il ya protéines contaminantes. Égaliser la concentration molaire de la protéine par l'addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2. 4. Nucleotide chargement de GTPase Décongeler une aliquote de billes magnétiques TPS-Rac1, préparés à l'étape 1. Prendre 90 pl de billes de GST-Rac1 et laver trois fois avec 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape. Aspirer à partir du tampon de perles et ajouter 100 ul de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT, 4 mM d'EDTA. Selon que le PIB, GTP ou non nucléotidique chargement est nécessaire pour l'expérience de la concurrence, ajouter 12 ul PIB 100 mM, 12 mM ul gu 10anosine 5 '- [γ-thio] triphosphate (GTPyS) ou pas de nucléotides à 60 pi perles TPS-Rac1. Pour les contrôles nucléotidique de chargement, les billes restantes divisé en trois aliquotes de 10 ul et ajouter 2 ul de 100 mM de PIB, 2 ul de 10 mM de GTPyS non nucléotidique ou de chaque tube. Incuber les mélanges de billes pendant 30 min à 30 ° C avec agitation. Stabiliser nucléotidique liée Rac1 par addition de 1 M de MgCl2: 3 pi du mélange à expérimental (étape 4.4), 0,5 pi à chacun des mélanges de commande (étape 4.5). 5. Concurrence contraignant. Mettre en place 6 microtubes, contenant chacun: 200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2 10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l'étape (4.7) 5 ul de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant) Pour chaque tube, ajouter 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 ul de protéine B de liaison à Rac1 (protéine de liaison variable). Ces volumes supposent unnviron concentrations d'achat d'actions égales des protéines de liaison constants et variables et peuvent avoir besoin d'être ajustée. Ajustez les volumes de protéines de liaison A et B, si il ya de grandes différences dans les affinités de liaison des deux protéines et cela devrait être déterminées empiriquement à travers les répétitions expérimentales. Porter au volume total du mélange de liaison à 235 ul par addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2. Mettre en place un tube de centrifugeuse contenant: 200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2 10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l'étape (4.7) 10 pi de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant) Mettre en place le PIB, GTPyS et pas de tubes de contrôle de nucléotides: 200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2 10 pi de billes de Rac1 de contrôle chargés dans l'étape 4.5 avec le PIB, GTPyS ou non nucléotidique et stabilisées dans l'étape 4.7. 180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysat préparé comme dans l'étape 3.6 4 ul de MgCl2 1 M Incuber le mélange pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C. Laver les billes trois fois avec 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2. Éluer les protéines liées dans 20 pi de tampon d'échantillon réducteurs (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% de SDS, 20% de glycerol, 0,02 mg / ml de bleu de bromophénol, 5% β-mercaptoethanol). 6. Analyse de la concurrence Résoudre 10 ul de la protéine liée (étape 5.6) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sodium (SDS-PAGE) et transfert de Western. Incuber la membrane à 4 ° CO / N en anticorps anti-GFP dilué 1/1000 dans un tampon bloquant dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20 pour détecter à la fois des protéines de liaison marquées GTPase. Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20. Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante dans 800 DyLight conjugué anti-lapin secanticorps secon-, dilué à 1 / 10.000 en tampon de blocage dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20. Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20. Analyser la membrane en utilisant un système d'imagerie infrarouge, en utilisant le logiciel pour mesurer l'intensité des bandes selon le protocole du fabricant. Tracer l'intensité de chaque bande de protéine par rapport au volume du concurrent variable (Protein B). Diviser le volume de concurrent variable au point où les lignes se croisent sur le volume d'concurrent constant (protéine A, 5 pi) pour déterminer le rapport de concurrent à laquelle l'équilibre est atteint. Pour la validation de l'état de chargement de nucleotides, des membranes de sonde pour p21-activated kinase 1 (PAK1) (un effecteur) et GFP-TrioD1 (a FEM), comme décrit dans les étapes 6.1-6.6.

Representative Results

Ce protocole est conçu pour calculer les affinités relatives des partenaires de liaison pour Rac1, sans avoir besoin de connaître la concentration précise des concurrents (Figure 1). Détermination de la concentration en protéine et introduit des erreurs lors de l'examen compétition entre les molécules dans une voie de signalisation préalable. Cependant, il est important de savoir que les deux concurrents ont la même concentration molaire dans les solutions de réserve pour permettre des rapports simples à calculer lors de l'ajout des volumes différents de l'essai. 40 ul de billes GFP-Trap ont une capacité de liaison de ~ 300 pmol de sorte qu'une confluence de 75 cm 2 flacons de très cellules exprimant se saturer les billes, de sorte que les préparations des deux protéines de liaison différents seront similaires avant l'ajustement (Figure 2A). Si l'on exprime les protéines de mal, ce problème peut être surmonté par la purification de cette protéine à partir de plus d'un flacon de cellules. <p class = "jove_content"> La liaison de la plupart des effecteurs et des régulateurs de GTPase dépend de la nucleotide-chargement de la GTPase de l'appât, il est donc important de tester si le chargement a réussi. Le chargement peut être vérifiée par précipitation de protéines de liaison connus à partir de lysats cellulaires. Protéines effectrices, comme la liaison de GTP PAK1-Rac1 et peuvent être facilement précipité à partir de lysats et détectées par Western blot 8 (figure 2B). GEFS lier préférentiellement au nucléotide sans GTPase de stabiliser l'état de transition. Comme GEF sont de faible abondance, habituellement inactifs et éponger souvent mal, il est préférable de surexprimer une FEM ou d'un fragment du FEM à l'essai gratuitement GTPase nucléotides. Nous utilisons souvent le premier homologie Dbl du Trio, exprimé comme une fusion GFP (GFP-TrioD1 9) (figure 2B), mais toute FEM travailler. Les protéines qui se lient à la GTPase de PIB chargé sont plus rares. Nous avons récemment rapporté RCC2 comme l'une telle protéine 7, ou le PIB de chargement peut être validé simplement comme binding à FEM ni ni effecteur. La sortie à partir de l'expérience sera un transfert de Western illustrant les deux partenaires de liaison marqués GFP liés à la GTPase. En utilisant un seul anticorps pour détecter les deux protéines, les concentrations auxquelles des quantités similaires des deux concurrents se lient peuvent être déterminées et donc les affinités relatives déduites. Dans cet exemple, la concurrence entre le domaine de l'hélice de la protéine Rac1-trafic, coronine-1C (Rac1-binding protein A), et la protéine Rac1-séquestrant, RCC2 (Rac1-binding protein B), est démontré (figure 3A). En utilisant un volume constant de coronine-1C hélice (5 pi), et en ajoutant des volumes croissants de RCC2, nous pouvons voir de la GFP efface que l'équilibre est atteint à 1,25-2,5 ul de RCC2 (astérisque), démontrant que RCC2 a une plus forte affinité pour Rac1 que coronine-1C. En mesurant l'intensité des bandes en utilisant quantitative Western blot, et le tracé des valeurs moyennes pour chaque competitor, le point d'équilibre peut être calculée avec précision, en identifiant les volumes à laquelle se coupent les courbes (figure 3B). L'un des obstacles possibles à un dosage de compétition est réussie si les partenaires de liaison se lient les uns aux autres ainsi que la liaison à Rac1. Dans la figure 3A + B nous démontrons la concurrence entre RCC2 et le domaine de l'hélice de coronine-1C, plutôt que sur toute la longueur coronine-1C. La raison pour utiliser le coronine tronquée est que coronine-1C se lie également RCC2 à travers le domaine de la queue. Lorsque pleine longueur coronine-1C est titré contre RCC2, la liaison de deux protéines est détectée, en raison de la formation complexe ternaire, plutôt que la concurrence (figure 3C). Si la concurrence est en cours, la liaison d'une protéine va augmenter tandis que les autres baisses, et lié total GFP-fusion restera constant. Dans les cas où un complexe ternaire se forme, il est nécessaire de tronquer une de la protéine GTPase se liant de sorte que la competvisi- plus interagir. Figure 1. Workflow. Représentation schématique du flux de travail pour déterminer l'affinité des protéines de GTPase liaison en utilisant des analyses de la concurrence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. La validation des protéines purifiées. (A) purifiée GFP-étiqueté protéines analysées par transfert de Western de liaison, sondant avec anti-GFP pour déterminer le rendement relatif des deux protéines Rac1. Ce type d'égalisation pendant l'expérience permet la concentration des deux protéines à être réglé de façon qu'ils correspondent à l'expérience de liaison. (B) GDP, GTPyS et aucun nucléotide chargé TPS-Rac1 a été incubé avec un lysat de HEK293T exprimant la GFP-TrioD1 et protéines détectées en traçant pour PAK1 endogène ou surexprimé GFP-TrioD1 liés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Analyse par Western blot de la protéine par rapport Exemple sorties contraignant. À partir des essais de compétition de liaison. (A) PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-coronine-1C domaine de l'hélice et de l'augmentation des volumes de GFP-RCC2 ont été titrés en jeu. En Western blot des protéines liées à GFP, des problèmes avec détection différentielle des deux protéines sont évités et le signal de la GFP indique le rapport molaire entre les deux protéines de fusion. Les astérisques indiquent les rapports de concurrence sur eithecôté r du point d'équilibre. (B) des intensités de bande des protéines liées à la GFP de fusion de trois expériences indépendantes ont été mesurées par quantitative Western Blot, en utilisant des anticorps et moyennes secondaires fluorophores conjugué comploté pour calculer le montant de RCC2 nécessaire pour atteindre l'équilibre. (C ) Exemple de sortie à partir d'une expérience dans laquelle des protéines de liaison à Rac1 lient les unes aux autres et forment un complexe ternaire, au lieu de la compétition. PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-RCC2 et l'augmentation des volumes de GFP-coronine-1C pleine longueur ont été titrés. L'augmentation liée GFP-coronine-1C sans perte de borne GFP-RCC2 indique formation d'un complexe ternaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

This protocol describes a method for comparing the relative affinities of pairs of small GTPase-binding proteins. The key steps are the preparation of purified GTPase-binding proteins and the nucleotide loading of the GTPase. The use of GTPase-binding proteins with the same GFP tag, allows the concentrations at which similar amounts of each competitor binds to be accurately determined. The use of recombinant nucleotide-loaded GTPase allows interrogation of the binding properties of the GTPase under specific activity conditions. This step is also the most sensitive as nucleotides will both hydrolyze and detach from the GTPase if the magnesium conditions are not maintained precisely.

In the cell, the large number of GTPase-binding proteins combined with the rapid nucleotide turnover makes such pathways difficult to interpret. The simplicity of this method in comparing only pairs of binding proteins and using carefully controlled nucleotide-loading conditions allows signaling pathways to be elucidated. However, the greatest strength of the protocol is also the greatest weakness as it is a simplification of the in vivo situation. Competition assays can be used to build a robust hypothesis, but this should then be tested in cells by knockdown experiments.

There are three features that must be considered when selecting the GFP-tagged GTPase-binding proteins to be used in the experiment. First, the fusion proteins must express well in mammalian cells, such as HEK293T, as competition assays require a reasonable amount of protein. Second, it must be possible to purify the recombinant protein without significant degradation, and where this is not possible, cloning of a GTPase-binding fragment should be considered. Third, the two GTPase-binding proteins must resolve from one another on SDS-PAGE to allow analysis in section 6.

There are a number of potential caveats to the experiment that need to be considered, and possibly addressed:

Possible denaturation of purified GTPase-binding proteins during the acid elution step or steric hindrance by the GFP tag. In our hands, these have not been a problem, but must be tested. The purified proteins can be tested in functional assays ¹⁰. Commercial kits now exist for testing the activity of GEFs or GAPs without the need for isotope-labeled nucleotides. Sequestering proteins, by their nature protect GTPases from GEF or GAP activity, so can be used as competitive inhibitors in the commercial GEF or GAP assays, as we did in our recent publication ⁷. The relevant feature of proteins that traffic GTPase are the capacity to bind the GTPase, and this can be tested easily in a pull down assay. An alternative approach to testing protein integrity that is applicable to all binding proteins is to titrate protein eluted from GFP-trap beads with glycine with the same protein removed from GFP-trap beads by enzymatic cleavage. The experiment would be analyzed by probing both the GFP-tagged and cleaved protein with an antibody against the protein itself. If the protein is undamaged by elution, equilibrium should be achieved at a 1:1 ratio. This approach would also indicate whether the presence of the GFP tag itself compromises the binding properties of the candidate protein, though this does require the production of a construct with an enzymatic cleavage site between the tag and the binding protein. Whether the protein is compromised by the tag or the elution step, the problem could be addressed by modifying the protocol to use an alternative purification method. Rather than GFP, binding proteins could be His-tagged, purified using Ni-NTA and analyzed using an antibody against the His-tag. The important feature is that both binding proteins must share a common tag although, if necessary, two tags could be added to a protein, one for purification and the other for detection.

The protocol is designed to investigate competition between interactions with the switch I/II domains. Although the majority of GTPase interactions are mediated by this motif, there are some exceptions, most notably the interactions of GDIs that bind to the prenyl tail, as well as obscuring the switch domains. In principle, the protocol could be adapted to use GTPase purified from mammalian cells, so that the GTPase is prenylated, however, the presence of multiple binding sites or allosteric effects complicate the interpretation of competition-binding data. Further problems associated with such a modification are that GDIs co-purify with GTPase from mammalian cells, compromising the purity of the isolated proteins and the hydrophobic nature of the prenyl groups means that prenylated GTPases are associated with either GDI or lipid membrane and such factors would need to be considered in the experiment.

The amount of GST-Rac1 being used in the assay. The constant GTPase binding protein must be at a greater concentration than the Rac1, or when the competitor is added, it will simply bind to free Rac1. It will be immediately obvious if this has happened as binding of the competitor, without a loss of the constant protein, will be detected in much the same way as when the two competing proteins bind to one another as shown in Figure 3B. As an additional control (Step 5.3), a binding reaction containing double the amount of constant binding protein and no variable binding protein should be included (Step 5.3). If the Rac1 in the titration experiment is saturated, doubling the amount of constant binding protein will have no effect on the output. The volumes suggested in the protocol should be appropriate, but the amount of Rac1 can be easily reduced. If binding of the competitor without loss of the constant binding partner is observed, reducing the amount of Rac1 should be attempted before trying to map binding sites to avoid ternary complex formation.

Non-specific interaction of GTPase-binding proteins with the GST or bead, as well as specifically with Rac1. This problem would be manifested by residual binding of the constant GTPase-binding protein, even when the variable GTPase-binding protein has reached a plateau at high concentration. Identification of this issue will be aided by conducting reciprocal experiments where the constant and variable GTPase-binding proteins are swapped. Reciprocal experiments will also greatly improve the accuracy of the estimate of equilibrium point, so should always be included. In cases of non-specific binding, the relative concentrations at which equilibrium is achieved can still be calculated by comparing band intensity between the maxima and minima for each protein, or by measuring the extent of non-specific binding by using GST beads as bait, rather than GST-Rac1.

Pull down assays using different nucleotide-loading conditions should be used to complement the competition assay described in this protocol. Determining the nucleotide preference of partners is important for both understanding the competition events and understanding the signaling pathway that the GTPase-binding protein is involved in. In Figure 2B we analyze binding of proteins with established preference for GTP-loaded or nucleotide-free GTPase as a means to validate nucleotide loading. However, it is sensible to investigate the effect of nucleotide loading on each of the competitors as well. If the hypothetical competitors show different preferences, competition will make less of a contribution to the signaling pathway, and indeed nucleotide turnover is likely to be the mechanism that directs exchange of the binding proteins.

Materials

Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE protease inhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathione magnetic beads	Pierce	88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antibody	Living Colors	632592	Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antibody	Cell Signaling	2602S	Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System	Li-cor	9260-11PC