Brug<em> Ex vivo</em> Upright dråbedistribution Kulturer af Whole Fetal organer til at studere udviklingsprocesser under Mus Organogenesis
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
Undersøgelse organogenesis i livmoderen er en teknisk udfordrende proces i placenta pattedyr på grund af manglende adgang til reagenser til embryoner, der udvikler inden livmoderen. En nyudviklet ex vivo opretstående dråbe kultur metode giver et attraktivt alternativ til undersøgelser udført i livmoderen. Ex vivo dråbe kultur giver mulighed for at undersøge og manipulere cellulære interaktioner og diverse signalveje gennem brug af forskellige blokering og aktiverende forbindelser; Derudover kan virkningerne af forskellige farmakologiske reagenser på udviklingen af specifikke organer studeres uden uønskede bivirkninger af systemisk lægemiddeltilførsel i livmoderen. I forhold til andre in vitro-systemer, dråben kultur ikke kun giver mulighed for evnen til at studere tredimensionale morfogenese og celle-celle-interaktioner, som ikke kan reproduceres i mammale cellelinier, men kræver også betydeligt mindre rReagenter end andre ex vivo og in vitro protokoller. Dette demonstrerer korrekt muse føtalt organ dissektion og opretstående dråber dyrkningsteknikker, efterfulgt af helorgan immunofluorescens at demonstrere effektiviteten af metoden. Ex vivo dråber dyrkningsmetode tillader dannelsen af organet arkitektur sammenlignes med, hvad der observeres in vivo og kan anvendes til at studere ellers er vanskelige at undersøgelse processer på grund af embryonisk letalitet i de vivo modeller. Som model ansøgningssystem, vil en lille molekyle inhibitor anvendes til at undersøge den rolle, vaskularisering i testikel morfogenese. Denne ex vivo dråbe dyrkningsmetode kan udvides til andre føtale organsystemer, såsom lunge- og potentielt andre, selv om hvert organ skal være grundigt undersøgt for at fastslå eventuelle organspecifikke ændringer af protokollen. Dette orgel kultur system giver fleksibilitet i eksperimenter med føtale organer, og resultater obtained hjælp af denne teknik vil hjælpe forskerne få indsigt i fosterudviklingen.
Introduction
Orgel regenerering in vivo hos mennesker er meget begrænset; derfor vævsmanipulering, udvikling af væv og organer fra individuelle celler doneret af en vært, er ved at blive et attraktivt terapi for udskiftning organ. Men for denne terapeutiske strategi skal lykkes, faktorer og cellulære interaktioner involveret i morfogenese af organet skal være grundigt undersøgt og godt forstået. På grund af den manglende evne til at studere udviklingen af specifikke organer med traditionelle metoder, har forskere slået til alternative hele embryo eller hele organkulturer. Kalaskar et al. 1 har vist, at ex vivo hel embryogenese kultur giver sammenlignelige resultater (i 58% af dyrkede embryoer) til i livmoderen udvikling, hvilket tyder på, at ex vivo kultur metoder er et realistisk alternativ for organogenesen studier.
En individualiseret organ dyrkningssystem, som denne ex vivo droPlet dyrkningssystem, giver mulighed for helorgan analyse uafhængig af systemiske effekter, mens den tillader manipulation af en bestemt signalvej eller cellulære interaktioner via tilsætning af farmakologiske reagenser eller antistoffer. Traditionelt har studiet af udviklingen føtalt organ er begrænset til transgene og knockout museteknologier, foruden farmakologiske reagenser leveret moderen. Men der er tekniske problemer, der involverer disse teknikker og behandlinger in vivo; de fleste bekymringer kredser omkring effekten af at påvirke forskellige organer samtidigt som ofte resulterer i embryonale dødelighed. Et yderligere problem undersøgelser manipulere fosterudviklingen farmakologisk er den maternelle effekt af lægemidler på fosterudviklingen i livmoderen (f.eks maternel metabolisme af lægemidlet før det når embryo) og hvis sådanne reagenser kan passere gennem placentabarrieren.
Hele organkultur teknikken beskrevether blev tilpasset fra en protokol først beskrevet af Maatouk et al. 2, hvor hele føtale gonader inkuberes i ex vivo opretstående dråbe kulturer. En væsentlig fordel ved dyrkning føtale gonader er, at små molekyler inhibitorer let kan få adgang til hele organet ved simpel diffusion. . DeFalco et al har vist, at udnytte denne ex vivo dråbe dyrkningsmetode i forbindelse med små molekyler inhibitorer kan bruges til at studere signalering processer og interaktioner, der opstår under gonade udvikling 3; disse processer ville være vanskeligt at undersøge in vivo på grund af tekniske udfordringer (f.eks passage af narkotika gennem moderkagen eller dødelighed påvirke flere organer ved hjælp af genetiske eller farmakologiske tilgange).
Dråben kultur er ikke kun en forbedring af visse aspekter end i livmoderen eksperimenter, men det er også en forbedring i forhold in vitro og ex viVo systemer. Er yderst vanskeligt at anvende cellelinier for at studere morfogenese fordi de mangler de forskellige celletyper, mangler kritiske ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, der tillader dannelsen af organet arkitektur og kan udvise artefakter i signaleringskaskader. Selvom tissue engineering har gjort betydelige forbedringer i at skabe stilladser simulerer ECM, manglende viden med hensyn til hvilke signaler kræves af hver celletype under organogenesen gør det udfordrende at bygge et organsystem in vitro. Andre ex vivo systemer er tidligere blevet etableret for at studere organogenese, eller mere specifikt morfogenese, og har været en stor succes for levende billeddannelse af føtale organer i agar 4, Transwells 5, filtre 6, og andre stillads matricer 7,8. Fordelen af dråben dyrkningssystem er, at det tillader undersøgelse af morfogenese ved at tilvejebringe evnen til at udnytte mindre reagenser, som er often dyrt, men også at give orglet overfladespænding, hvilket er vigtigt for vækst og signalering kapaciteter 9.
I musen, oprindelige testis morfogenese finder sted mellem embryoniske (E) trin E11.5 og E13.5; disse faser omfatter den optimale tidsvindue for behandlingen af faktorer, der påvirker kønsspecifik differentiering. Blandt de kritiske processer, der opstår under testis dannelsen er dannelsen af testis ledningen arkitektur og dannelsen af et testis-specifikke vaskulære netværk. Udnytte denne ex vivo helorgan dråbe dyrkningssystem, man er i stand til at ændre den mandlige-specifikke vaskularisering og inhiberer testis morfogenese ved anvendelse af en lille-molekyle inhibitor, som blokerer aktiviteten af receptorerne for vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF); VEGF-medieret vaskulær remodellering er kritisk for testis udvikling 10-12. Denne teknik kan med held anvendes til andre organer og kan målrette bestemt tidspunktvinduer i udvikling. Hele-mount orgel billedbehandling giver mulighed for visualisering af vitale strukturer samt strukturelle og cellulære ændringer som følge af administrationen af forskellige inhibitorer. Vigtigere er det, dette system er fordelagtig ved, at forskeren kan omgå potentielle forstyrrende effekter fra moderens lægemiddelindgivelse eller systemisk forstyrrelse under de vivo målgenet strategier. Således kan ex vivo dråber kultur-system hele denne orgel i betydelig grad forbedre evnen til at forstå samspillet og signalering, som forekommer specielt inden for bestemte organer under fosterudviklingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse viser pt ex vivo helorgan dråbemetoden, der har mange potentielle anvendelser til at studere føtale udvikling. Denne teknik kan bruges til flere organer, og tillader forskeren at behandle biologiske spørgsmål, der er vanskelige at behandle under anvendelse af in vivo metoder på grund af utilgængelighed af embryoner og potentielle embryonisk letalitet. Denne dyrkningsmetode har yderligere fordele i forhold til andre in vitro metoder, såsom mammale cellelinier…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
Referências
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
