Avaliação das propriedades imunomoduladora de mesenquimais humanas Células-Tronco (MSCs)

Summary

As propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas (MSC) aparecem cada vez mais relevante para a aplicação clínica. Usando um sistema de co-cultura de MSCs e leucócitos do sangue periférico de pré-corados com o éster succinimidilo corante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), descreve-se a avaliação in vitro de MSC imunomodulação em proliferação e subpopulações efectoras de leucócitos específicos.

Abstract

As propriedades imunomoduladoras das células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) de várias linhagens parecem ser altamente relevantes para uso clínico em uma ampla gama de doenças relacionadas ao sistema imunológico. Os mecanismos envolvidos estão sendo cada vez mais elucidados e, neste artigo, descrevemos o experimento básico para avaliar a imunomodulação das CTMs por meio do ensaio para supressão da proliferação de leucócitos efetores. Representando a ativação, a proliferação de leucócitos pode ser avaliada por uma série de técnicas, e descrevemos neste protocolo o uso do corante celular fluorescente carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFSE) para marcar leucócitos com análises citométricas de fluxo subsequentes. Esta técnica pode não apenas avaliar a proliferação sem radioatividade, mas também o número de divisões celulares que ocorreram, além de permitir a identificação da população específica de células em proliferação e a expressão intracelular de citocinas/fatores. Além disso, o ensaio pode ser adaptado para avaliar populações específicas de leucócitos efetores por seleção de marcadores de superfície de esferas magnéticas de populações únicas de células mononucleares do sangue periférico antes da co-cultura com MSCs. A flexibilidade deste ensaio de co-cultura é útil para investigar interações celulares entre MSCs e leucócitos.

Introduction

Células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) são progenitores somáticas que podem se diferenciar em linhagens mesodérmicos paraxiais as de osso, cartilagem, tecido adiposo e ^1-4, bem como a um extramesodermal algumas linhagens ^5. Primeiro isolada a partir da medula óssea adulta, estes progenitores multilinhagem foram agora encontrados em vários tecidos e ^6-8, inesperadamente, mostraram ter fortes propriedades imunomoduladoras que aparecem altamente passível de aplicação clínica ^9-12. Mecanismos detalhados envolvidos nos efeitos imunomoduladores estão ativamente sendo investigado por aplicação efectiva sobre as entidades d....

Protocol

O consentimento informado do paciente conforme aprovado pelo conselho de revisão institucional deve ser obtido para o uso de células humanas.

1. Densidade de isolamento gradiente de sangue periférico humano as células mononucleares (PBMC)

1. Adicionar 25 ml de sangue total heparinizado em um tubo de 50 ml por uma pipeta de 25 ml.
   1. Dilui-se as células com 25 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Adicionar 15 ml de gradiente de densidade de Ficoll-Paque em um novo tubo de 50 ml, e, enquanto a inclinação do tubo, muito lentamente e cuidadosamente adicionar 25 ml da suspensão diluída de células ....

Results

A Figura 1 indica o esquema geral do experimento, e A Figura 2 demonstra a aparência das várias condições de cultura de células tal como visualizado por microscopia de contraste de fase invertida. MSC são células aderentes com um fibroblástica, morfologia fusiforme, enquanto que PBMCs e leucócitos são pequenas células não-aderentes redondos. Estes dois tipos de células morfologicamente diferentes pode ser claramente visto na co-cultura. No fim do ensaio, quando os PBMC (ou leuckotyes) são aspiradas para cit.......

Discussion

Cada vez mais, as propriedades imunomoduladoras das CTMs estão sendo traduzidas em uso clínico mais rapidamente do que a capacidade multilinhagem dessas^{células-tronco 18-20}. Assim, técnicas de co-cultura de CTMs com leucócitos e ensaios para avaliar a função imune são importantes para delinear ainda mais os mecanismos específicos envolvidos nessas propriedades para otimizar a aplicação terapêutica eficaz.

Um dos aspectos técnicos mais críticos para o sucesso nesses ensaios é ter nú.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Densidade grandiente para isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
Kit Vibrante de Traçador de Células CFDA-SE (CFSE)	Life Technologies	V12883	Etiqueta celular para detecção de divisão celular
Fitoaglutinina (PHA)	Sigma	L8902	Ativação de PBMCs humanos
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Ativação de linfócitos T humanos, e.g. CD4+ células T, CD8+ células T, etc.
autoMACS™ Separador	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separador	Separador de célula baseado em magnético
autoMACS® Colunas	Miltenyi Biotec	130-021-101	colunas de separação
CD14 microesferas, humanas	Miltenyi Biotec	130-050-201	Para seleção positiva de monócitos e macrófagos CD14+ de
microesferas CD4 PBMCs, humanas	Miltenyi Biotec	130-045-101	Para seleção positiva de linfócitos T humanos CD4+ de PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	PBMC humano/meio de cultura de leucócitos
DMEM, baixa glicose, piruvato	Life Technologies	11885	Meio de cultura de células-tronco mesenquimais humanas (MSC)
L-glutamina	Life Technologies	25030-081	Suplementação para MSC meio completo
Penicilina/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Suplementação para PBMC/leucócitos e MSC meio completo
Soro fetal bovino (FBS)	1) Hyclone, para cultura MSC                                    2) Life Technologies, para todas as outras células (ou seja, PBMCs, populações específicas de leucócitos)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Lotes de pré-teste para suporte de MSC in vitro placa
de cultura de células de 24 poços Placa	co-cultura	Corning	COR3524
Tubo de centrífuga de 50 ml	PBMCs de isolamento de 430291 de sangue total por tubo de centrífuga Ficoll-Paque PLUS
de 15 ml	Corning	430766	Coleção das frações celulares marcadas e não marcadas
Tubos de fundo redondo	BD Falcon	352008	Coleta de células para análise por citometria de fluxo