Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Recogida de sangre repetida es una de las técnicas más comunes que se realizan en animales de laboratorio. Sin embargo, no se ha establecido un protocolo no letal para la recogida de sangre de pez cebra. Los métodos anteriores para la recogida de sangre de pez cebra son letales, como la incisión lateral, la decapitación y la ablación de la cola. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método de extracción de sangre "repetida", y presentar aquí un protocolo detallado que describa este procedimiento. Este método es mínimamente invasiva y se traduce en una tasa de mortalidad muy baja (2,3%) para el pez cebra, lo que permite tomar muestras de sangre repetidas del mismo individuo. El volumen máximo de muestreo de sangre es dependiente sobre el peso corporal de los peces. El volumen para el muestreo de sangre repetida a intervalos debe ser ≤0.4% del peso corporal cada semana o ≤1% cada 2 semanas, que fueron evaluados mediante mediciones de la hemoglobina de la sangre. Además, la hemoglobina, glucemia en ayunas, triglicéridos en plasma (TG) yc totalesSe midieron los niveles holesterol en el pez cebra adultos masculinos y femeninos. También se aplica este método para investigar la desregulación del metabolismo de glucosa en la obesidad inducida por la dieta. Este método de extracción de sangre permitirá a muchas aplicaciones, incluyendo la glucosa y el metabolismo de los lípidos y los estudios hematológicos, lo que aumentará el uso de pez cebra como modelo de enfermedad organismo humano.
Introduction
El pez cebra están ganando cada vez mayor popularidad como un modelo valioso de enfermedades humanas debido a que sus órganos y la genética son similares a los de los humanos 1,2. En el campo de la biología del desarrollo, muchos estudios han demostrado que el pez cebra y el espectáculo humano marcados similitud en la hematopoyesis 3, hemostasia 4,5, y mielopoyesis 6. Pez cebra adulto también se utilizan para el estudio inmunológico 7, 8 y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la obesidad 9 porque este organismo modelo comparte vías comunes con los perturbado en enfermedades humanas. Para la obesidad y las enfermedades relacionadas con la obesidad (diabetes, esteatosis hepática y la esteatohepatitis no alcohólica y aterosclerosis), la glucosa en sangre y los niveles de lípidos del pez cebra se han investigado a fondo en varios modelos de obesidad transgénicos y inducidos por la dieta 10-13.
Muestreo de sangre repetida de animales individuales reducirá el uso de animales y diciembreRease diferencias interindividuales. Sin embargo, la recogida de muestras repetida es técnicamente difícil en animales pequeños, tales como el pez cebra debido a su relativamente pequeño volumen de sangre y la falta de vasos de fácil acceso. Varios métodos para la recogida de sangre de una sola vez de pez cebra se han desarrollado, aunque estos métodos tienen sus propios inconvenientes, incluyendo letalidad, daño tisular asociado y el volumen sanguíneo limitado. Por ejemplo, 1-5 de sangre l puede ser cosechado a partir de una incisión lateral de aproximadamente 0,3 cm de longitud en la región de la aorta dorsal 5. Decapitación con tijeras de corte a través de la cintura escapular puede cobrar 5-10 l de sangre 10. Otro método de muestreo de sangre conveniente es la ablación de la cola 14. Punción cardiaca es una potencial método alternativo para la recogida de sangre repetida de un mismo pescado, pero la cantidad muy pequeña obtenido (aproximadamente 50 nl) con este procedimiento limita el número de análisis que pueden ser PERFORmed 11. En consecuencia, se necesita un nuevo protocolo para permitir repetido muestreo de sangre no letal, que sería un avance crítica necesaria para este organismo para ser un organismo modelo estándar para enfermedades humanas. Esta técnica permitiría para el ensayo de respuesta farmacológica, el descubrimiento de biomarcadores moleculares para el diagnóstico, determinación del pronóstico y el seguimiento de diversas enfermedades, tales como enfermedades metabólicas, enfermedades degenerativas y varios tipos de tumores malignos.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método mínimamente invasivo para la obtención de sangre de pez cebra en serie 15. Aquí se demuestra el procedimiento visual y proporcionar un protocolo detallado para esta técnica. Usando este método, se evaluó el valor normal basado en diversos parámetros, incluyendo la hemoglobina, glucemia en ayunas y lípidos en la sangre de pez cebra adultos sanos. Además, también se evaluó si este método es adecuado para estudios que requieren muestras seriadas de mONITOREO los cambios temporales en los niveles de glucosa en la sangre durante los experimentos de sobrealimentación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos aquí un protocolo detallado para la obtención seriada sangre de pez cebra adulto. Este método es sencillo de llevar a cabo y la usamos en el laboratorio en una base diaria. Este método de extracción de sangre se basa en la inserción de una aguja capilar de vidrio en aorta dorsal del pez cebra. Durante este procedimiento, es crítico que tener cuidado para no realizar la ablación de la columna vertebral debido a que es el criterio para la búsqueda de la aorta dorsal. La reducción de la lesión de la …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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