Generation av genetiskt modifierade Organotypiska Skin kulturer Använda devitaliserad Human Dermis
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Organotypiska kulturer medge rekonstitution av en 3D-miljö kritiska för cell-cellkontakt och cell-matris-interaktioner som härmar funktion och fysiologi av deras in vivo vävnads motsvarigheter. Detta exemplifieras av organotypiska hud kulturer som troget rekapitulerar epidermal differentiering och stratifiering program. Primära humana epidermala keratinocyter är genetiskt manipuleras genom retrovirus där gener kan lätt överuttryckta eller nedslagen. Dessa genetiskt modifierade keratinocyter kan sedan användas för att regenerera human epidermis i organotypic hud kulturer tillhandahåller en kraftfull modell för att studera genetiska vägar slag epidermal tillväxt, differentiering, och sjukdomsutveckling. De protokoll som presenteras här beskriver metoder för framställning av devitaliserade human hud såväl som genetiskt manipulera primära humana keratinocyter för att generera organotypic hud kulturer. Regenererad människohud kan användas i downstrEAM applikationer såsom genuttryck profilering, immunfärgning, och kromatin immunoutfällningar följt av hög genomströmning sekvensering. Således kommer genereringen av dessa genetiskt modifierade organotypiska hud kulturer tillåter bestämningen av gener som är kritiska för att bibehålla hudens homeostas.
Introduction
De mänskliga epidermis är ett skiktat epitel som ansluter till de underliggande dermis genom en extracellulär matris kallas basalmembran zone.The epidermis inte bara fungerar som en ogenomtränglig barriär för att förhindra förlusten av fukt, men också som en första försvarslinje för att skydda kroppen från främmande och giftiga ämnen 1. Det basala skiktet, som är det djupaste lagret av överhuden, innehåller den epidermala stam- och stamfaderceller som ger upphov till den differentierade avkomma som bildar resten av epidermis 2. Som epidermala prekursorceller differentierar de migrerar uppåt för att bilda det första skiktet av differentierade celler som kallas spinosus skiktet 3. I spinosus skiktet, celler slå på uttrycket av keratiner 1 och 10, som sedan ger den styrka för att motstå fysisk stress för de differentierade skikten av epidermis. Som spinous skikt celler differentierar vidare, flyttar de uppåt i överhuden till förm det granulära skiktet, som kännetecknas av bildningen av keratohyalin och lamellära granuler samt strukturella proteiner som är sammansatta under plasmamembranet. Eftersom cellerna vidare i differentieringsprocessen, proteinerna nedanför plasmamembranet är kors kopplade till varandra medan de lamellära granuler extruderas från cellerna för att bilda en lipid rik barriär kallas hornlagret 4.
Sjukdomar som involverar förändringar i epidermal tillväxt och differentiering inverkan ~ 20% av befolkningen 5. Sålunda förstå mekanismerna för denna process är av stor betydelse. Eftersom manifestation av många av dessa sjukdomar är knuten cell cell eller cell-matrix kontakt har organotypic kulturer där de mänskliga epidermis rekonstitueras i en 3D-miljö skapats 6-10. Dessa metoder involverar typiskt användningen av primära eller transformerade keratinocyter sådda på extracellulär matrix såsom devitaliserad humantdermis, Matrigel eller kollagen.
För att förstå genreglerande mekanismer som är viktiga i epidermal tillväxtfaktor och differentiering, kan keratinocyter genetiskt manipuleras genom retrovirala vektorer för att knockdown eller överuttrycka gener i 2D kultur och rekonstituerades därefter i 3D. Dessa metoder har använts i stor utsträckning för att karakterisera gener involverade i epidermal stam och stamceller självförnyelse och differentiering samt progression till neoplasi 11-21. Här är en fördjupad protokoll om hur du ändrar genuttryck i epidermala organotypiska kulturer genom användning av retrovirus tillhandahålls.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetisk manipulation i mänsklig hud organotypiska kulturer erbjuder många fördelar gemensamt studerat 2D odlade celler samt musmodeller. 2D kulturer saknar de tredimensionella cell-cell- och cell-extracellulär matrix-interaktioner funna i intakta vävnader och organ. Nyligen genomförda studier har också funnit enorma skillnader mellan 2D- och 3D-odlade hud cancerceller med 3D odlade celler som visar mycket mer genuttryck likheter med primära humana hudtumörer 16. Mänskliga organotypiska hud kulturer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var supportedby American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) och CIRM Basic Biology Award (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
Referências
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
