Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Organotipik kültürlerinin fonksiyonu ve de vivo doku meslektaşları fizyolojisini taklit hücre-hücre teması ve hücre-matriks etkileşimlerinin önemli bir 3 boyutlu bir ortamda tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu sadakatle epidermal farklılaşma ve tabakalaşma programı özetlediği Organotipik cilt kültürler tarafından örneklenmiştir. Birincil insan epidermal keratinositler genleri kolayca aşırı veya aşağı çalınabilecek retrovirüslere yoluyla genetik olarak manipüle vardır. Bu genetik olarak değiştirilmiş keratinositler daha sonra genetik yollar, darbe epidermal büyüme farklılaşmasını ve hastalığın ilerlemesini araştırmak için güçlü bir model sağlanması Organotipik bir deri kültürlerinde, insan epidermisi yeniden oluşturmak için kullanılabilmektedir. Burada sunulan protokoller cansız insan dermiş hazırlanması hem de genetik olarak Organotipik bir deri kültürü oluşturmak için primer insan keratinositleri işlemek için yöntemleri tarif eder. Rejenere insan deri downstr kullanılabilirBöyle gen ifade profilleme, immün ve yüksek verimlilik sıralaması takip kromatin İmmüno olarak eam uygulamaları. Bu nedenle, bu genetik olarak değiştirilmiş organotipik cilt kültürlerin nesil cilt dengesini sağlamaya yönelik kritik genlerin belirlenmesini sağlayacaktır.
Introduction
İnsan üst deri değil, aynı zamanda korumak için savunma bir birinci hattı olarak nem kaybını önlemek için sızdırmaz bir bariyer olarak hizmet eder bazal membran zone.The epidermis olarak bilinen hücre dışı bir matris boyunca yatan dermiş bağlanan bir tabakalı epitelyumdur yabancı ve zehirli maddelerden 1 vücut. Epidermisin derin katmanı bazal tabaka, epidermis 2 kalanını oluşturan farklılaşmış döl doğuran epidermal kök ve progenitör hücreler içerir. Epidermal progenitör hücrelerin ayırt olarak bunlar Spinoz tabakanın 3 olarak da bilinir farklılaşmış hücrelerin birinci tabakayı oluşturmak üzere yukarı doğru göç eder. Spinöz katmanda, hücreler daha sonra epidermis farklılaşmış katmanları fiziksel strese dayanma gücünü sağlayan keratinlerden 1 ve 10 ifadesi, açın. Spinöz tabaka hücreleri daha farklılaştırmak, onlar için epidermisin yukarı hareketplazma zarı altına monte edilir keratohyalin ve lameller granül oluşumunun yanı sıra, yapısal proteinlerin karakterize granüler tabaka m. Hücreler farklılaşma sürecinde devam ederken katmanlı granüller zengin koruyucu stratum corneum adı verilen bir lipidi 4 oluşturmak için hücreler ekstrüde edilirken, plazma membranı altından proteinleri birbirine çapraz bağlı bulunmaktadır.
Epidermal büyüme ve farklılaşma etkisi ~ nüfusun 5% 20 değişiklikleri içeren hastalıklar. Bu durumda, bu işlemin mekanizmalarının anlaşılması önem taşımaktadır. Bu hastalıkların birçoğu tezahürü hücre-hücre veya hücre-matris temas etmesine bağlıdır, insanın epidermisin 3 boyutlu bir ortamda yeniden oluşturulur Organotipik kültürler 6-10 oluşturuldu. Bu yöntemler, tipik olarak, cansız insan gibi hücre dışı matrisin üzerine ekildi primer ya da dönüştürülmüş keratinositlerin kullanılmasını içerirDermiş, Matrigel veya kollajen.
Epidermal büyüme ve farklılaşmasında önemli bir gen düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, genetik olarak keratinositler 2B kültür genleri demonte veya aşın ifade etmek üzere retroviral vektörler ile işlenmesi ve sonra 3D içinde yeniden edilebilir. Bu yöntemler, neoplazi 11-21 epidermal kök ve projenitör hücre kendini yenileme ve farklılaşma gibi ilerlemesinde rol oynayan genleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, retrovirüsler kullanımı yoluyla epidermal organotipik kültürlerinin gen ekspresyonunu değiştirmek için nasıl derinlemesine bir protokolü temin edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organotipik kültürler birçok avantaj sunan insan derisinde Genetik manipülasyon yaygın 2B kültür hücreleri yanı sıra fare modelleri okudu etmek. 2B kültürleri sağlam organ ve dokularda bulunan üç boyutlu bir hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris etkileşimlerine yoksundur. Son çalışmalar da 16 tümörler birincil insan derisine çok daha fazla gen ifadesi benzerlikleri gösteren 3D kültür hücreleri ile 2D ve 3D kültür cilt kanseri hücreleri arasındaki muazzam farklar bulduk. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği Araştırma Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) ve CIRM Temel Biyoloji Ödülü (RB4-05779) supportedby oldu.
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
Referências
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
