Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Relativt vilande somatiska stamceller stödja livslång cellförnyelse i de flesta vuxna vävnader. Neurala stamceller i den vuxna däggdjurshjärnan är begränsade till två specifika neurogena nischer: den subgranular zonen av gyrus dentatus i hippocampus och den ventrikulära-subventrikulära zonen (V-SVZ; även kallad subependymalt zon eller SEZ) i väggarna i den laterala ventriklarna. Utvecklingen av genöverföring in vivo strategier för vuxna stamceller (dvs. de av däggdjurshjärnan) resulterar i långtids uttryck av önskade transgener i stamcellerna och deras härledda avkomma är ett viktigt verktyg i nuvarande biomedicinsk och bioteknisk forskning. Här, är ett direkt in vivo-metod som presenteras för den stabila genetisk modifiering av vuxen mus V-SVZ celler som drar nytta av den cellcykeloberoende infektion genom LVs och mycket specialiserad cytoarchitecture för V-SVZ nisch. Specifikt, det nuvarande protokollet innebärs injektion av tomma LVs (kontroll) eller LVs kodar specifika transgena expressionskassetter i antingen V-SVZ självt, för målsökning av alla typer av celler i den nisch in vivo, eller in i de laterala lumen ventrikeln, för målsökning av ependymala celler endast. Expressionskassetter sedan integreras i genomet hos de transducerade cellerna och fluorescerande proteiner, även kodas av LVS, tillåter detektion av de transducerade cellerna för analys av cell autonoma och icke-självständiga, nischberoende effekter i de märkta cellerna och deras avkomma.
Den murina ventrikulär-subventrikulära zonen (V-SVZ), i väggarna i den laterala ventrikeln som vetter striatum, är en mycket aktiv germinal region där en kontinuerlig process av progenitorcell replikering och differentieringsresulterar i ihållande produktion av luktloben (OB ) interneuronen och corpus callosum oligodendrocyter 1. Livslångt generationen av dessa celler förefaller stödjas av närvaron i denna region av neurala stamceller (NSCs, även kallade B1 celler), som uttrycker astrocytisk antigen gliafibrillärt surt protein (GFAP) och stamcellsmarkörer såsom nestin, Id1 och Sox2 2. GFAP-uttryckande B1 celler genererar transit förstärka stamfader (TAP) celler (C-celler), som uttrycker transkriptionsfaktorer Dlx2 (distal mindre homeobox 2) och Ascl1 (däggdjur achaete-schute homolog 1) och dela snabbt några gånger innan de ger upphov att migrera neuroblaster (A-celler) eller oligodendroblasts 3. Nyligen genererade prolifrativa neuroblaster migrerar anteriort, bildar rostrala migrationsbanan (RMS) till OB, där de integreras i det granulära och glomerulära lager som differentierade hämmande intern. Migrera unga oligodendroblasts flytta till CC, där de blir omogna NG2-positiva celler som fortsätter att dela lokalt eller differentiera till mogna myeliniserande oligodendrocyter 1,4.
B1 celler, som härrör från fetala radiella gliaceller, behålla den långsträckta och polarise morfologi av sina föregångare och uppvisar en högt specialiserad relation med sin nisch. De spänner mellan ependymceller som ställer upp kammaren och nätverket av blodkärl som vattna V-SVZ nisch. Den lilla apikala process av B1 celler interkalerar bland multiciliated ependymocytes och slutar i en enda icke-rörliga primär cilium, medan deras basala process sträcker sig långa sträckor för att närma sig den plana vaskulära plexus som bevattnar denna nisch slutar i BAsal lamina av plexus kapillärerna 2,5-8.
Det säkraste sättet att skilja B1-NSCs från icke-neurogen astrocyter, som också GFAP +, i den intakta V-SVZ nisch är baserad på hela montering beredningar av ventrikeln sidovägg och deras analys av 3-D konfokalmikroskopi efter immunfärgning för GFAP för att märka den tunna B1-NSC apikala process, β-catenin att avgränsa cellmembran, och antingen γ-tubulin som en markör för cilial basala organ eller acetylerad α-tubulin för att märka utsträckningen av alla cilie 5,8. Observationer av dessa hel-fästen från kammarytan har indikerat att B1 och ependymala celler är arrangerade i "vindsnurror" 5, i vilka uniciliated apikala processer en eller flera GFAP + B1 celler omgivna av en rosett av multiciliated ependymala celler.
Den karakteristiska morfologi B1 celler korrelerar med experimentella bevis indicating att blodkärl / endotelceller och ventrikulära cerebrospinalvätskan (CSF) utgör reglerade källor av lösliga signaler som verkar på NSCs 2,6,9-11. Vid ventrikulära ytan, homotypisk och hetero apico-lateral interaktioner mellan ependymala och B1 celler inkluderar tight junctions och zonula adhaerens 5,12. Dessutom adhesionsmolekyler som är inblandade i de junctionala komplex mellan B1 och ependymala celler, såsom N-cadherin och V-CAM, har visat att reglera inte bara den mycket organiserad positionering av B1 i V-SVZ nisch, men också deras quiescence 12 13. Det ependymala-B1 cellmonoskiktet tycks verka som en diffusionsbarriär som tillåter den reglerade flödet av vatten och små molekyler från CSF, men begränsar den intercellulära passagen av stora proteiner 10,11. Experimentella bevis indikerar att en unik position B1 cell apikala cilium skulle kunna spela en roll som en sensor av signalering polypeptider förekommer i cerebrospinalvätskan 2,5-7. Ependymala celler är i sig också en källa av lösliga och membranbundna signaler med en roll i regleringen av NSC beteende 14,15.
Spårbara nukleosider, såsom brom-deoxiuridin (BrdU) eller retrovirus har använts i stor utsträckning för att märka progenitorceller, inklusive NSCs, in vivo. Men dessa metoder inte är optimala för långsiktig öde spårning eftersom BrdU signaler späd genom upprepade celldelningar och retrovirus verkar företrädesvis rikta gående förstärkning celler på grund av deras krav på celltillväxt för transduktion 16,17. För att undersöka NSC fysiologi in vivo, inklusive interaktion med nischkomponenter, är det viktigt att fastställa en metod för att märka och spåra sällan delande celler, som B1-NSCs är i stort sett stilla och deras grann ependymala celler delar aldrig under fysiologiska förhållanden 3. Här visar vi att lentivirala vektorer (LVs) möjliggöra högeffektiv gen märkeing och långsiktig modifiering av vuxna NSCs och icke-delande ependymala celler, på grund mest rimligt att deras förmåga att transducera och att integrera in i genomet hos målceller i en cellcykeloberoende sätt. Dessutom visar vi hur rutten för leverans och virustiter hjälp att specifikt transducera ependymala celler, men inte B1 celler vilket möjliggör analysen av nischberoende, ependymala effekter på NSCs.
LVs erbjuder viktiga fördelar jämfört med andra virala system för genetisk modifiering av vuxna NSCs 16,18. Stereotaktisk leverans av lentivirus till V-SVZ nisch representerar en effektiv metod för att märka och spåra sällan dela B1-NSCs övervinna begränsningarna i andra vanligen använda metoder såsom BrdU, som späds efter flera celldelningar, eller retrovirus, som bara målceller som breder vid tidpunkten för ansökan. LVs, tillsammans med adenovirus kan infektera celler oberoende av deras cyke…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner hjälp av MJ Palop och tekniskt stöd från SCSIE av Universidad de Valencia. Vi tackar också Antonia Follenzi för värdefulla kommentarer och diskussion av manuskriptet. IF stöds av Fundación Botin, av Banco Santander genom sin Santander universitet Global Division, och med bidrag från Valencias (Prog Prometeo, ACOMP och ISIC) och Ministerio de Economía y Competitividad (Mineco: SAF2011-23331, CIBERNED och RETIC Tercel) . Detta arbete stöddes också av BFU2010-21823 och RETIC Tercel bidrag från Mineco och Europeiska forskningsrådet (ERC) 2012-StG (260511- PD-HUMMODEL) AC BM-P. är mottagare av en spansk FPI gemenskap Mineco.
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
Equipment: | |||
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
Reagents: | |||
pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
Equipment: | |||
Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
Reagents: | |||
Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
Bleach/Virkon | Dupont | ||
Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Part 3: Histological analysis. | |||
Equipment: | |||
Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
Vibratome | Leica | VT1000 | |
Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
Reagents: | |||
Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
Superglue | LOCTITE | 767547 | |
Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |