Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relatief rustige somatische stamcellen ondersteunen levenslange celvernieuwing in de meeste volwassen weefsels. Neurale stamcellen in de hersenen volwassen zoogdieren zijn beperkt tot twee specifieke neurogene niches: de subgranulaire zone van de dentate gyrus in de hippocampus en de ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ, ook wel subependymal zone of SEZ) in de wanden van de laterale ventrikels. De ontwikkeling van in vivo genoverdracht-strategieën voor volwassen stamcellen populaties (dwz die van de hersenen van zoogdieren) resulterend in lange termijn expressie van transgenen in de gewenste stamcellen en hun nakomelingen afkomstig is een cruciale rol spelen bij huidig ​​biomedisch en biotechnologisch onderzoek. Hier wordt een directe in vivo methode gepresenteerd voor de stabiele genetische modificatie van volwassen muizen V-SVZ cellen die gebruik maakt van de celcyclus-onafhankelijke infectie door LVs en de zeer gespecialiseerde cytoarchitecture van de V-SVZ niche. In het bijzonder, het huidige protocol te betrekkens de injectie van lege LVs (controle) of LVs codeert specifieke transgene expressiecassettes in hetzij de V-SVZ zelf, voor de in vivo targeting van alle cellen in de nis of in de laterale ventrikel lumen, voor het richten van ependymale alleen cellen. Expressiecassettes worden vervolgens geïntegreerd in het genoom van de getransduceerde cellen en fluorescerende eiwitten, eveneens gecodeerd door de LVs, zodat de detectie van de getransduceerde cellen voor de analyse van cel autonome als niet-autonome, niche-afhankelijke effecten van de gelabelde cellen en hun nakomelingen.

Introduction

De muizen ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ), in de wanden van de laterale ventrikel tegenover het striatum, is een zeer actief germinale gebied waarin een continu proces van voorlopercellen celdeling en differentiatie leidt tot de aanhoudende productie van bulbus olfactorius (OB ) interneuronen en corpus callosum oligodendrocyten ^1. De levenslange genereren van deze cellen blijkt te worden door de aanwezigheid in deze regio van neurale stamcellen (NSC's; ook wel B1 cellen), waarbij de astrocytaire antigeen glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) tot expressie en stamcel markers zoals nestine, Id1 en Sox2 ^2. GFAP expressie B1 cellen genereren transit versterken voorlopercellen (TAP) cellen (C-cellen), die tot expressie transcriptiefactoren Dlx2 (distale-less homeobox 2) en Ascl1 (zoogdieren Achaete-Schute homoloog 1) en verdeel snel een paar keer voordat ze aanleiding geven te migreren neuroblasts (A-cellen) of oligodendroblasts ^3. Nieuw-gegenereerde ProlifERATIVE neuroblasts migreren naar voren, de vorming van de rostrale migratiestroom (RMS) aan de OB, waar ze te integreren in de granulaire en glomerulaire lagen zo gedifferentieerd remmende interneuronen. Migreren jonge oligodendroblasts verplaatsen naar de CC, waar ze worden onvolwassen NG2-positieve cellen die nog steeds lokaal splitsen of te differentiëren tot rijpe myeliniserende oligodendrocyten ^1,4.

B1 cellen, die afkomstig zijn van foetale radiale gliale cellen behouden langwerpig en gepolariseerde morfologie van hun voorgangers en vertonen een zeer gespecialiseerde relatie met hun niche. Omspant tussen de ependyma welke lijnen de ventrikel en het netwerk van bloedvaten die de V-SVZ niche irrigeren. De kleine apicale proces van B1 cellen intercalaten onder multiciliated ependymocytes en eindigt in een enkele niet-beweeglijke primaire cilium, terwijl hun basale proces strekt zich lange afstanden naar de vlakke vasculaire plexus dat deze niche einde bevloeit in de b benaderenasal lamina van de plexus haarvaten ^2,5-8.

De meest betrouwbare manier om B1-NSCs onderscheiden van niet-neurogene astrocyten, die ook GFAP ^+, in het intacte V-SVZ niche in gehele-mount preparaten van de ventrikel zijwand en de analyse van 3-D confocale microscopie na immunokleuring voor GFAP de dunne B1-NSC apicale proces, β-catenine label celmembranen af te bakenen, en ofwel γ-tubuline als een marker van cilial basale organen of geacetyleerde α-tubuline om het etiket van de omvang van elk cilium ^5,8. Opmerkingen van deze hele mounts van de ventriculaire oppervlak hebben aangegeven dat B1 en ependymale cellen zijn opgesteld in "vuurraderen" ^5, waarbij de uniciliated apicale processen van één of meer GFAP ⁺ B1 cellen worden omringd door een rozet van multiciliated ependymale cellen.

De karakteristieke morfologie van B1 cellen correleert met experimenteel bewijs indicating die de bloedvaten / endotheelcellen en ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF), vormen geregeld bronnen van oplosbare signalen die op NSC ^2,6,9-11. Bij de ventriculaire oppervlak, homotypische en heterotypische apico-laterale interacties van ependymale en B1 cellen omvatten krappe kruispunten en adherens kruispunten ^5,12. Bovendien adhesiemoleculen betrokken bij de junctionele complexen tussen B1 en ependymale cellen, zoals N-cadherine en V-CAM, is aangetoond dat niet alleen de zeer georganiseerde positionering van B1 regelen de V-SVZ niche, maar ook hun rust ^{12 , 13.} De ependymale-B1 cel monolaag lijkt te werken als een diffusiebarrière waardoor de afgestelde stroom van water en kleine moleculen uit de CSF, maar beperkt de doorgang van grote intercellulaire eiwitten ^10,11. Experimenteel bewijs geeft aan dat de unieke positie B1 cel apicale cilium een rol kunnen spelen als een sensor van signalering Polypeptiden aanwezig in de CSF ^2,5-7. Ependymale cellen zijn op zich een bron van oplosbare en membraangebonden signalen met een rol in de regulatie van NSC gedrag ^14,15.

Traceerbaar nucleosiden, zoals broom- deoxyuridine (BrdU) of retrovirussen zijn op grote schaal gebruikt om progenitorcellen, waaronder NSCs label in vivo. Deze werkwijzen zijn niet optimaal voor de lange termijn gebeurt tracing omdat BrdU signalen verdund door herhaalde celdelingen en retrovirussen lijken preferentieel richten tijdelijk amplificeren van cellen als gevolg van de eis van celproliferatie voor transductie ^16,17. Om NSC fysiologie in vivo, met inbegrip van interacties met niche componenten te onderzoeken, is het cruciaal om een methode om te labelen en te traceren zelden delende cellen, zoals B1-NSCs zijn grotendeels rustig en hun naburige ependymale cellen nooit verdelen onder fysiologische omstandigheden ³ vast te stellen. Hier laten we zien dat lentivirale vectoren (LVs) zorgen voor high-efficiency-gen marking en langdurige wijziging van volwassen NSCs en niet-delende ependymale cellen, vanwege meest redelijk om hun vermogen te transduceren en te integreren in het genoom van de doelcellen in een celcyclus-onafhankelijke manier. Verder tonen we aan hoe de route van aflevering en virale titer hulp specifiek transduceren ependymale cellen, maar niet B1 cellen waardoor de analyse van niche-afhankelijke, ependymale effecten op NSC toestaan.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Valencia in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63 / EU. 1. Generatie van LV voor in vivo Markering Studies (zie figuur 1a) LET OP: De procedure hier beschreven is bioveiligheidsniveau 2, dus het uitvoeren van de volgende procedures in een biohazard kap. Ervoor te zorgen dat onderzoek personeel voldoende gekwalificeerd en opgeleid in alle procedures. Draag persoonlijke bescherming…

Representative Results

LV-gemedieerde genafgifte kan worden gebruikt voor de lange termijn in vivo transductie van cellen in volwassen muizen V-SVZ, waardoor hun tracking en genetische modificatie tijdens proliferatie, migratie en differentiatie. De infectie en de expressie zijn zeer effectief en geven talrijke cellen die gemakkelijk onderscheiden onder andere niet-geïnfecteerde cellen kunnen worden door de expressie van het opgenomen. We hebben tot dusver gevisualiseerd cellen getransduceerd met GFP fluorescente reporters, dankzij …

Discussion

LVs bieden belangrijke voordelen boven andere virale systemen voor de genetische modificatie van volwassen NSC ^16,18. Stereotaxische levering van lentivirussen de V-SVZ niche vertegenwoordigt een efficiënte methode te labelen en te traceren zelden delen B1-NSC overwinnen van de beperkingen van andere gebruikelijke werkwijzen zoals BrdU, die verdund na meerdere celdelingen of retrovirus, die op doelcellen die prolifererende op het moment van toepassing. LVs, alsmede adenovirussen kunnen cellen ongeacht hun po…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations