הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
יחסית בתאי גזע שקט סומטיים לתמוך התחדשות התאים לכל החיים ברוב רקמות בוגרות. תאי גזע עצביים במוח של יונקים בוגרים מוגבלים שתי גומחות נוירוגנית ספציפיים: אזור subgranular של gyrus משוננת בהיפוקמפוס ואת אזור חדרית-subventricular (V-SVZ; המכונה גם subependymal אזור או SEZ) בקירות של לרוחב חדרים. פיתוח אסטרטגיות העברת גני in vivo עבור אוכלוסיות תאי גזע בוגרים (כלומר אלה של מוח יונקים) וכתוצאה מכך ביטוי לטווח הארוך של transgenes הרצוי תאי הגזע וצאצאים הנגזרות מהם הוא כלי מרכזי במחקר ביו ביוטכנולוגיים הנוכחי. כאן, שיטה ישירה in vivo מוצגת לגבי ההנדסה הגנטית היציבה של תאי V-SVZ עכבר בוגר שמנצלת את זיהום המחזור עצמאי התא על ידי LVS ואת cytoarchitecture מאוד המיוחד של נישת V-SVZ. באופן ספציפי, הפרוטוקול הנוכחי לערבזה הזרקה של LVS ריק (שליטה) או LVS קידוד קלטות ביטוי transgene מסוים לתוך או V-SVZ עצמה, עבור in vivo מיקוד של כל סוגי התאים נישה, או לתוך לומן החדר לרוחב, עבור מיקוד של ependymal תאים בלבד. קלטות ביטוי אז הם משולבים לתוך הגנום של התאים transduced וחלבונים פלורסנט, מקודדים גם על ידי LVS, לאפשר זיהוי של תאי transduced לניתוח תא אוטונומיים ובלתי אוטונומיות, תופעות תלויות נישה בתאים שכותרתו שלהם צֶאֱצָאִים.
Introduction
אזור murine חדרית-subventricular (V-SVZ), בקירות החדר לרוחב מול בסטריאטום, הוא אזור נבטי מאוד פעיל בו תהליך מתמשך של תוצאות בידול שכפול תאים ובתאים בייצור מתמשך של הנורה חוש הריח (OB interneurons) ו oligodendrocytes כפיס המוח 1. הדור לכל החיים של תאים אלו מופיעים להיות נתמכים על ידי נוכחות באזור זה של תאי גזע עצביים (NSCs; המכונים גם תאי B1), המבטאים את חלבון גליה fibrillary חומצי אנטיגן astrocytic (GFAP) גזע סמני תא כגון nestin, ID1 ו Sox2 2. GFAP-לבטא בתאי B1 ליצור מעבר הגברה אבי תאים (TAP) (תאים C), המבטאים שעתוק גורמי Dlx2 (דיסטלי פחות homeobox 2) ו Ascl1 (homolog achaete-schute יונקים 1) ולחלק כמה פעמים במהירות לפני שהם להצמיח כדי neuroblasts הנודדת (תאי א) או oligodendroblasts 3. חדש שנוצר prolifneuroblasts erative להעביר anteriorly, ויצר נחל נודדות המקורי (RMS) אל OB, שם הם להשתלב הפרטניים ושכבות גלומרולרי כמו interneurons מעכבות בדיל. Oligodendroblasts הצעיר נודד לעבור CC, שם הם הופכים תאי NG2 חיובי מפותחים אשר ממשיכים להתחלק באופן מקומי או להתמיין oligodendrocytes myelinating הבוגר 1,4.
תאי B1, אשר נובעים ותאי גלייה רדיאלי עובריות, לשמר את המורפולוגיה המוארכת ומקוטבת של קודמיהם ולהציג מערכת יחסים מאוד מיוחדת עם הנישה שלהם. הם משתרעים בין התא אפנדימלי אילו קווים את החדר ואת הרשת של כלי דם להשקות את נישת V-SVZ. תהליך הפסגה הקטן של intercalates תאי B1 בין ependymocytes multiciliated ומסתיים cilium העיקרי יחיד שאינו ניע, ואילו התהליך הבסיסי שלהם משתרע למרחקים ארוכים להתקרב מקלעת כלי הדם מישוריים כי משקה סוף הנישה זו בlamina ASAL של נימי מקלעת 2,5-8.
הדרך האמינה ביותר להבחין B1-NSCs מ האסטרוציטים הלא נוירוגנית, שהן גם GFAP +, בגומחה V-SVZ שלם מבוסס על כל הר ההכנות של הקיר לרוחב החדר וניתוח שלהם על ידי מיקרוסקופ confocal 3-D אחרי immunostaining עבור GFAP לתייג את תהליך הפסגה B1-המל"ל דק, β-catenin להתוות קרום התא, ואו γ טובולין כסמן של גופים הבסיס cilial או acetylated α-טובולין לתייג את היקף כל cilium 5,8. תצפיות של כל-mounts אלה מפני שטח חדרית הראו כי תאי B1 ו- ependymal מסודרים "גלגלי רוח" 5, שבה תהליכי פסגת uniciliated של GFAP אחד או כמה + B1 תא מוקפים שושנה של תאי ependymal multiciliated.
המורפולוגיה האופיינית של תאי B1 בקורלציה עם ראיה נסיונית indicating כי כלי דם / תאי האנדותל חדרית נוזל השדרתי (CSF) מהווה מקורות מוסדרים של אותות מסיסים הפועלים NSCs 2,6,9-11. על פני החדר, homotypic ואינטראקציות apico-לרוחב heterotypic שמקורם בתאי דם ependymal ו- B1 כוללים צמתים הדוקים adherens צמתים 5,12. יתר על כן, מולקולות הדבקה מעורב מתחמי junctional בין התאים B1 ו- ependymal, כגון N-cadherin ו- V-CAM, הוכחו להסדיר לא רק את המיקום מאורגן של B1 בגומחה V-SVZ, אלא גם קפאון שלהם 12 , 13. Monolayer התא ependymal-B1 מופיע לפעול כמחסום דיפוזיה המאפשר השטף מוסדר מים ומולקולות קטנות מן CSF, אבל הגבלת המעבר בין תאית של חלבונים גדולים 10,11. ראיה נסיונית עולה כי cilium הפסגה בתא B1 ממוצבת באופן ייחודי יכול לשחק תפקיד כחיישן של איתות פוליפפטידים נוכח CSF 2,5-7. תאים Ependymal הם, כשלעצמם, גם מקור של אותות מסיסים קרום הנכנס עם תפקיד בוויסות התנהגות המל"ל 14,15.
נוקלאוזידים לעקיבה, כגון bromo-deoxyuridine (BrdU), או רטרווירוסים היה בשימוש נרחב לתייג ובתאים, כולל NSCs, in vivo. עם זאת, שיטות אלה אינן אופטימליים עבור מעקב גורל לטווח ארוך משום שאותות BrdU לדלל באמצעות חלוקות תא חוזרים רטרווירוסים נראה כי הן מיועדות מועדפות הגברה זמן תאים עקב הדרישה שלהם של התפשטות תאים עבור תמרת 16,17. כדי לבחון פיזיולוגית המל"ל in vivo, כולל אינטראקציות עם רכיבי נישה, חשוב להקים שיטה לתייג ואת העקבות לעתים נדירות תאים מתחלקים, כמו B1-NSCs הם שקט בעיקר ותאי ependymal השכנות שלהם מעולם לחלק בתנאים פיסיולוגי 3. כאן, אנו מראים כי וקטורים lentiviral (LVS) לאפשר סימן גן-יעילות גבוההing ושינוי ארוך הטווח של NSCs המבוגר ותאי ependymal הלא חלוקה, בשל בסבירות המרובה ליכולתם transduce וכדי להשתלב בגנום של תאי יעד באופן מחזור עצמאי תא. יתר על כן, אנו מראים כיצד תוואי עזרה כייל משלוח ויראלי transduce תאים ependymal במיוחד, אבל לא התאים B1 ובכך לאפשר ניתוח של תלויי נישה, תופעות ependymal על NSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVS להציע יתרונות חשובים על פני מערכות ויראליות אחרות עבור ההנדסה הגנטית של מבוגר NSCs 16,18. משלוח Stereotaxic של lentiviruses לנישה V-SVZ מייצג שיטה יעילה לתייג ואת עקבות חלוקת B1-NSCs לעתים רחוקות להתגבר על המגבלות של שיטות נפוצות אחרות כגון BrdU, אשר נחלש לאחר חלוקות תא מרובים, או רט…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את עזרתו של MJ Palop ואת התמיכה הטכנית של SCSIE של ולנסיה Universidad de. אנו מודים גם אנטוניה Follenzi על הערות מועילות ודיון של כתב היד. אם הוא נתמך על ידי Fundacion Botìn, על ידי Banco Santander דרך חטיבת שלה סנטנדר אוניברסיטאות העולמי, ועל ידי מענקי Generalitat מוולנסיה (פרוגרמה Prometeo, ACOMP, ו ISIC) ו Ministerio דה Economìa y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED ו RETIC Tercel) . עבודה זו נתמכה גם על ידי BFU2010-21823 ו RETIC Tercel המענק MINECO ואת מועצת המחקר האירופית (ERC) 2012-STG (260511- PD-HUMMODEL) אי.סי BM-P. הוא זכה במלגה FPI ספרדי של MINECO.
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
Referências
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
- Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
- Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
- Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
- Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
- Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
- Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
- Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
- Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
- Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
- Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
- Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
- Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
- Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
