Стабильной и эффективной генетической модификации клеток у мышей взрослых V-СВЗ для анализа нейронных стволовых клеток автономный и Неавтономные эффекты
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
Относительно спокойные соматические стволовые клетки поддерживают пожизненное обновление клеток в большинстве тканей взрослого. Нервные стволовые клетки в головном мозге млекопитающих взрослого ограничены двумя конкретными нейрогенных ниш: The субгранулярной зона зубчатой извилине в гиппокампе и желудочковой-субвентрикулярная зоне (V-SVZ; также называемый Субэпендимальные зоны или ОЭЗ) в стенках бокового желудочки. Развитие в естественных стратегий переноса генов для популяций взрослых стволовых клеток (т.е. тех из мозга млекопитающих), в результате долгосрочного экспрессии желаемых трансгенов в стволовых клетках и их производного потомства является важным инструментом в текущем биомедицинских и биотехнологических исследованиях. Здесь прямой метод в естественных представлена для стабильного генетической модификации взрослых мышей V-СВЗ клеток, которое использует цикл независимый инфекции в клетку путем РН и узкоспециализированных цитоархитектуры в V-СВЗ нише. В частности, в настоящее время протокол привлекатьS инъекция пустых РН (контроль) или РН кодирующих специфические трансгенной экспрессии кассеты в либо самого V-СВЗ, для ориентации в естественных всех типов клеток в нише, или в боковой желудочек просвета, для нацеливания эпендимные клетки только. Экспрессионные кассеты, затем интегрируются в геном трансдуцированных клеток и флуоресцентных белков, также кодируемых РН, позволяют обнаружение трансдуцированных клеток для анализа клеточных автономных и неавтономных, ниши-зависимых эффектов в меченых клеток и их потомство.
Introduction
Мышиный желудочка-субвентрикулярная зона (V-SVZ), в стенках бокового желудочка, обращенной к полосатое тело, является очень активным зародышевых область, в которой непрерывный процесс репликации и дифференцировки клеток-предшественников приводит к стойким производства обонятельной луковицы (OB ) интернейронов и мозолистого тела олигодендроциты 1. Пожизненное поколение этих клеток, как представляется, подтверждается наличием в этом регионе нейронных стволовых клеток (НСК; также называемым B1 клеток), которые выражают астроцитов антиген глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и стволовых клеточных маркеров, таких как нестина, Id1 и Sox2 2. GFAP-экспрессирующих B1 клетки вырабатывают транзит усиливающую прародителя (TAP) клетки (C клеток), которые выражают транскрипционные факторы Dlx2 (дистальный менее гомеобоксный 2) и Ascl1 (млекопитающих achaete-schute гомолог 1) и разделить быстро несколько раз, прежде чем они порождают чтобы мигрирующих нейробластов (клетки а) или oligodendroblasts 3. Недавно созданный Пролифerative нейробласты мигрируют кпереди, образуя ростральный миграционный тракт (RMS) на ОВ, где они интегрироваться в гранулированных и клубочков слоев как дифференцированных ингибирующих интернейронов. Перенастройка молодые oligodendroblasts двигаться в ЦК, где они становятся незрелые NG2-позитивных клеток, которые продолжают делить локально или дифференцироваться в зрелые myelinating олигодендроцитов 1,4.
B1 клетки, которые вытекают из эмбриональных радиальных глиальных клеток, сохраняют вытянутую и поляризованный морфологию своих предшественников и имеют узкоспециализированный отношения с их нишу. Они охватывают между Эпендима, которая выстраивается желудочка и сети кровеносных сосудов, что орошать V-СВЗ нишу. Небольшой верхушечный процесс B1 клеток интеркалатов среди multiciliated ependymocytes и заканчивается в одной неподвижные первичной реснички, а их базальная процесс распространяется на большие расстояния, чтобы подойти к плоскую сосудистого сплетения, что орошает эту нишу окончание в бASAL пластинка из сплетения капилляров 2,5-8.
Самый надежный способ отличить B1-НСК из экологически нейрогенных астроцитов, которые также GFAP +, в неповрежденной V-СВЗ нише основан на весь монтажа препараты желудочка боковой стенке и их анализ от 3-D конфокальной микроскопии после иммунным для GFAP маркировать тонкие В1-НСК апикальная процесса, -катенин очертить клеточные мембраны, и либо γ-тубулина в качестве маркера cilial базальных телец или ацетилированный альфа-тубулина для мечения степень каждой реснички 5,8. Наблюдения этих цельного монтирует из желудочков поверхности показали, что B1 и эпендимные клетки расположены в "флюгеры" 5, в которой uniciliated апикальные процессы одного или нескольких GFAP + B1 клеток окружены розеткой multiciliated эпендимных клеток.
Характерная морфология B1 клеток коррелирует с экспериментальными данными яndicating, что кровеносные сосуды / эндотелиальные клетки и желудочковой цереброспинальной жидкости (ликвора) составляют регулируемые источники растворимых сигналов, действующих на НСК 2,6,9-11. В желудочковой поверхности, гомотипических и гетеротипические апикально-боковой взаимодействий с участием эпендимные и B1 клеток включают плотные соединения и слипчивые соединения 5,12. Кроме того, молекулы адгезии, вовлеченные в соединительных комплексов между B1 и эпендимных клеток, таких как N-кадгерина и V-CAM, как было показано, регулирует не только высоко организованную позиционирование B1 в V-SVZ нише, но также и их неподвижность 12 , 13. Клеточный монослой эпендимные-В1-видимому, действует в качестве диффузионного барьера, позволяющего регулируемое поток воды и малых молекул от CSF, но ограничивая межклеточное прохождение крупных белков 10,11. Экспериментальное доказательство показывает, что в уникальном положении В1 клеток апикальной ресничка может играть определенную роль в качестве датчика сигнализации полипептидов, присутствующих в CSF 2,5-7. Эпендимные клетки, как таковой, также является источником растворимых и мембраносвязанных сигналов с роли в регуляции поведения НСК 14,15.
Прослеживаемые нуклеозиды, такие как бром-дезоксиуридина (BrdU), или ретровирусов широко были использованы для обозначения клетки-предшественники, в том числе NSC, в естественных условиях. Тем не менее, эти методы не являются оптимальными для долгосрочного отслеживания судьбы, потому что BrdU сигналы разбавить путем многократных делений и ретровирусов клеток, по всей видимости преимущественно нацелены временно усиливая клетки из-за их требованию клеточной пролиферации для трансдукции 16,17. Чтобы исследовать НСК физиологию в естественных условиях, в том числе взаимодействия с компонентами ниши, очень важно создать способ маркировать и отслеживать редко делящиеся клетки, а B1-НСК в основном в состоянии покоя и их соседние эпендимные клетки никогда не разделить в физиологических условиях 3. Здесь мы покажем, что лентивирусов векторов (ПЗ) позволяют отметки гена высокоэффективнойING и долгосрочное изменение взрослых НСК и без разделительных эпендимных клеток, из-за наиболее разумно с их способностью к трансдукции и интеграции в геном клетки-мишени в пути клеточного цикла-независимыми. Кроме того, мы покажем, как маршрут доставки и титр вируса помощью специально преобразовывать эпендимные клетки, но не В1 клетки, тем самым позволяя анализировать ниши-зависимыми, эпендимных воздействия на НСК.
Protocol
Representative Results
Discussion
ПЗ предложить важные преимущества перед другими вирусными систем для генетической модификации взрослого НСК 16,18. Стереотаксическая доставка лентивирусах к V-СВЗ нише представляет собой эффективный метод, чтобы маркировать и отслеживать нечасто деления B1-НСК преодолеть огранич…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем помощь MJ Палоп и техническую поддержку SCSIE из Университета Валенсии. Мы также благодарим Antonia Follenzi за полезные замечания и обсуждение рукописи. ЕСЛИ поддерживается Фонд Ботин, по Banco Santander через ее Сантандер университетов глобальным вопросам, и за счет субсидий из генералитета Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP и МСОК) и Ministerio де Economia у Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED и RETIC TERCEL) , Эта работа была поддержана BFU2010-21823 и RETIC TERCEL грантов MINECO и Европейского исследовательского совета (ERC) 2012-STG (260511- PD-HUMMODEL) к сети переменного BM-P. является получателем испанской FPI общении MINECO.
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
Referências
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
- Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
- Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
- Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
- Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
- Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
- Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
- Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
- Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
- Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
- Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
- Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
- Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
- Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
