Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativamente células madre somáticas quiescentes apoyan la renovación celular de toda la vida en la mayoría de los tejidos adultos. Las células madre neurales en el cerebro adulto de mamíferos están restringidos a dos nichos neurogénicos específicos: la zona subgranular del giro dentado del hipocampo y la zona ventricular-subventricular (V-SVZ; también llamada zona subependimario o ZEE) en las paredes de los laterales ventrículos. El desarrollo de estrategias de transferencia génica in vivo para las poblaciones de células madre adultas (es decir, las del cerebro de los mamíferos) que resulta en la expresión a largo plazo de los transgenes deseados en las células madre y su progenie derivada es una herramienta crucial en la investigación biomédica y biotecnológica actual. Aquí, se presenta un método directo in vivo para la modificación genética estable de células de ratón adulto V-SVZ que se aprovecha de la infección de ciclo independiente de células por LVs y la citoarquitectura altamente especializado del nicho V-SVZ. En concreto, el protocolo actual implicaes la inyección de LVs vacíos (control) o LV codifican casetes de expresión de transgén específica en cualquiera de la propia V-SVZ, para la dirección in vivo de todos los tipos de células en el nicho, o en el lumen del ventrículo lateral, para la focalización de ependimarias Sólo las células. Los casetes de expresión se integran en el genoma de las células transducidas y las proteínas fluorescentes, también codificadas por el LVs, permitir la detección de las células transducidas para el análisis de células de efectos autónomos y no autónomos, de nicho dependiente en las células y se marcaron su progenie.

Introduction

La zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), en las paredes del ventrículo lateral hacia el cuerpo estriado, es una región germinal muy activo en el que un proceso continuo de replicación de células progenitoras y de diferenciación como resultado la producción persistente del bulbo olfatorio (OB interneuronas) y oligodendrocitos del cuerpo calloso ^1. La generación de toda la vida de estas células parece estar apoyada por la presencia en esta región de las células madre neurales (NSC, también llamadas células B1), que expresan la proteína ácida glial fibrilar antígeno de los astrocitos (GFAP) y marcadores de células tales como nestina, Id1 madre y Sox2 ^2. Que expresan GFAP células B1 generan células (TAP) (células C), que expresan factores de transcripción Dlx2 tránsito amplificar progenitora (distal-less homeobox 2) y Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) y dividir rápidamente un par de veces antes de que den origen a neuroblastos migran (células a) o oligodendroblasts ^3. Recién generada prolifeneuroblastos rativa migran hacia delante, formando la corriente migratoria rostral (RMS) para el OB, en la que se integran en el granulares y capas glomerulares como interneuronas inhibitorias diferenciadas. Migración de oligodendroblasts jóvenes se mueven a la CC, donde se convierten en células NG2 positivo inmaduras que siguen dividiendo a nivel local o diferenciarse en oligodendrocitos maduros myelinating ^1,4.

células B1, que derivan de las células gliales radiales fetales, conservan la morfología alargada y polarizada de sus predecesores y exhiben una relación altamente especializada con su nicho. Ellos abarcan entre el epéndimo, que se alinea el ventrículo y la red de vasos sanguíneos que irrigan el nicho V-SVZ. El pequeño proceso apical de las células se intercala entre B1 ependymocytes multiciliated y termina en un solo cilio primario no móvil, que en los procesos basales se extiende largas distancias para abordar el plexo vascular plana que irriga este nicho de final en el basal lámina de los capilares del plexo ^2,5-8.

La forma más fiable para distinguir B1-NSC a partir de astrocitos no neurogénicos, que también son GFAP ^+, en el nicho intacta V-SVZ se basa en todo el montaje de preparaciones de la pared lateral del ventrículo y su análisis por microscopía confocal 3-D después de inmunotinción para GFAP para etiquetar el proceso apical B1-NSC delgada, β-catenina para delinear las membranas celulares, y, o bien γ-tubulina como un marcador de cuerpos basales ciliar o acetilado α-tubulina para etiquetar la extensión de cada cilio ^5,8. Las observaciones de estos enteros monturas de la superficie ventricular han indicado que las células ependimales B1 y están dispuestas en ^"molinetes" 5, en el que los procesos apicales uniciliated de uno o varios GFAP ^{+ células} B1 están rodeadas por una roseta de células ependimarias multiciliated.

La morfología característica de células B1 se correlaciona con la evidencia experimental indicating que los vasos sanguíneos células endoteliales y ventriculares / líquido cefalorraquídeo (LCR) constituyen las fuentes reguladas de señales solubles que actúan sobre células madre neurales ^2,6,9-11. En la superficie ventricular, y las interacciones homotipica heterotípicos apico-lateral con células ependimarias y B1 incluir uniones estrechas y uniones adherentes ^5,12. Por otra parte, las moléculas de adhesión implicadas en los complejos de unión entre las células B1 y ependimarias, tales como N-cadherina y V-CAM, se ha demostrado que regular no sólo el posicionamiento altamente organizada de B1 en el nicho de V-SVZ, sino también su quiescencia ^{12 , 13.} La monocapa de células ependimarias-B1 parece actuar como una barrera de difusión que permite el flujo regulado de agua y las moléculas pequeñas de la CSF, pero restringiendo el paso intercelular de proteínas grandes ^10,11. La evidencia experimental indica que la celda B1 cilio apical posición única podría desempeñar un papel como un sensor de polipéptidos presentes en el LCR ² de ^{señalización,}5-7. Las células ependimarias son, per se, también una fuente de señales solubles y unidas a la membrana con un papel en la regulación del comportamiento NSC ^14,15.

Nucleósidos trazables, tales como bromo-desoxiuridina (BrdU), o retrovirus han sido ampliamente utilizados para marcar las células progenitoras, incluyendo NSCs, in vivo. Sin embargo, estos métodos no son óptimas para el rastreo destino a largo plazo ya que las señales BrdU diluido a través de repetidas divisiones celulares y retrovirus parecen estar dirigidas preferentemente de forma transitoria células debido a su requerimiento de la proliferación celular para la transducción ^16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiología in vivo, incluyendo las interacciones con los componentes de nicho, es crucial establecer un método para etiquetar y rastrear células rara vez se dividen, como B1-NSCs son en gran parte de reposo y sus células ependimarias vecinos nunca se dividen en condiciones fisiológicas ^3. Aquí, se muestra que los vectores lentiviral (LV) permiten una marca de genes de alta eficienciaING y modificación a largo plazo de NSCs adultas y que no se dividen las células ependimales, debido más razonablemente a su capacidad para transducir y para integrarse en el genoma de las células diana de una manera independiente del ciclo celular. Por otra parte, se muestra cómo la vía de administración y virales ayuda título para transducir específicamente a las células ependimarias, pero no los linfocitos B1 permitiendo así que el análisis de nichos dependiente, efectos ependimarias en células madre neurales.

Protocol

DECLARACIÓN DE ÉTICA: Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Valencia conforme a la Directiva Europea 2010/63 / UE. 1. Generación de LV para estudios in vivo de marcado (véase la figura 1a) PRECAUCIÓN: El procedimiento descrito en este documento es de bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, realizar todos los procedimientos siguientes en una campana de bioseguridad. Asegurarse que el personal de investigación son suficiente formación …

Representative Results

Sistema de entrega de genes mediada por LV se puede utilizar para el largo plazo en la transducción in vivo de células de la V-SVZ de ratón adulto, lo que permite su seguimiento y la modificación genética durante la proliferación, migración y diferenciación. La infección y la expresión son muy eficaces y producen numerosas células que se pueden distinguir fácilmente entre otras células no infectadas por la expresión del reportero incluido. Hasta ahora hemos visualizado células transducidas con GF…

Discussion

VL ofrecen importantes ventajas frente a otros sistemas virales para la modificación genética de las células madre neurales adultas ^16,18. la administración estereotáxica de lentivirus con el nicho V-SVZ representa un método eficiente para etiquetar y rastrear con poca frecuencia dividiendo B1-NSCs superar las limitaciones de otros métodos usados ​​comúnmente, tales como BrdU, que se diluye después de múltiples divisiones celulares, o retrovirus, que sólo las células diana que están prolifera…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations