Stabil och effektiv genetisk modifiering av celler i vuxen mus V-SVZ för analys av neurala stamceller autonoma och icke-självständiga effekter

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativt vilande somatiska stamceller stödja livslång cellförnyelse i de flesta vuxna vävnader. Neurala stamceller i den vuxna däggdjurshjärnan är begränsade till två specifika neurogena nischer: den subgranular zonen av gyrus dentatus i hippocampus och den ventrikulära-subventrikulära zonen (V-SVZ; även kallad subependymalt zon eller SEZ) i väggarna i den laterala ventriklarna. Utvecklingen av genöverföring in vivo strategier för vuxna stamceller (dvs. de av däggdjurshjärnan) resulterar i långtids uttryck av önskade transgener i stamcellerna och deras härledda avkomma är ett viktigt verktyg i nuvarande biomedicinsk och bioteknisk forskning. Här, är ett direkt in vivo-metod som presenteras för den stabila genetisk modifiering av vuxen mus V-SVZ celler som drar nytta av den cellcykeloberoende infektion genom LVs och mycket specialiserad cytoarchitecture för V-SVZ nisch. Specifikt, det nuvarande protokollet innebärs injektion av tomma LVs (kontroll) eller LVs kodar specifika transgena expressionskassetter i antingen V-SVZ självt, för målsökning av alla typer av celler i den nisch in vivo, eller in i de laterala lumen ventrikeln, för målsökning av ependymala celler endast. Expressionskassetter sedan integreras i genomet hos de transducerade cellerna och fluorescerande proteiner, även kodas av LVS, tillåter detektion av de transducerade cellerna för analys av cell autonoma och icke-självständiga, nischberoende effekter i de märkta cellerna och deras avkomma.

Introduction

Den murina ventrikulär-subventrikulära zonen (V-SVZ), i väggarna i den laterala ventrikeln som vetter striatum, är en mycket aktiv germinal region där en kontinuerlig process av progenitorcell replikering och differentieringsresulterar i ihållande produktion av luktloben (OB ) interneuronen och corpus callosum oligodendrocyter ^1. Livslångt generationen av dessa celler förefaller stödjas av närvaron i denna region av neurala stamceller (NSCs, även kallade B1 celler), som uttrycker astrocytisk antigen gliafibrillärt surt protein (GFAP) och stamcellsmarkörer såsom nestin, Id1 och Sox2 ^2. GFAP-uttryckande B1 celler genererar transit förstärka stamfader (TAP) celler (C-celler), som uttrycker transkriptionsfaktorer Dlx2 (distal mindre homeobox 2) och Ascl1 (däggdjur achaete-schute homolog 1) och dela snabbt några gånger innan de ger upphov att migrera neuroblaster (A-celler) eller oligodendroblasts ^3. Nyligen genererade prolifrativa neuroblaster migrerar anteriort, bildar rostrala migrationsbanan (RMS) till OB, där de integreras i det granulära och glomerulära lager som differentierade hämmande intern. Migrera unga oligodendroblasts flytta till CC, där de blir omogna NG2-positiva celler som fortsätter att dela lokalt eller differentiera till mogna myeliniserande oligodendrocyter ^1,4.

B1 celler, som härrör från fetala radiella gliaceller, behålla den långsträckta och polarise morfologi av sina föregångare och uppvisar en högt specialiserad relation med sin nisch. De spänner mellan ependymceller som ställer upp kammaren och nätverket av blodkärl som vattna V-SVZ nisch. Den lilla apikala process av B1 celler interkalerar bland multiciliated ependymocytes och slutar i en enda icke-rörliga primär cilium, medan deras basala process sträcker sig långa sträckor för att närma sig den plana vaskulära plexus som bevattnar denna nisch slutar i BAsal lamina av plexus kapillärerna ^2,5-8.

Det säkraste sättet att skilja B1-NSCs från icke-neurogen astrocyter, som också GFAP ^+, i den intakta V-SVZ nisch är baserad på hela montering beredningar av ventrikeln sidovägg och deras analys av 3-D konfokalmikroskopi efter immunfärgning för GFAP för att märka den tunna B1-NSC apikala process, β-catenin att avgränsa cellmembran, och antingen γ-tubulin som en markör för cilial basala organ eller acetylerad α-tubulin för att märka utsträckningen av alla cilie ^5,8. Observationer av dessa hel-fästen från kammarytan har indikerat att B1 och ependymala celler är arrangerade i "vindsnurror" ^5, i vilka uniciliated apikala processer en eller flera GFAP ⁺ B1 celler omgivna av en rosett av multiciliated ependymala celler.

Den karakteristiska morfologi B1 celler korrelerar med experimentella bevis indicating att blodkärl / endotelceller och ventrikulära cerebrospinalvätskan (CSF) utgör reglerade källor av lösliga signaler som verkar på NSCs ^2,6,9-11. Vid ventrikulära ytan, homotypisk och hetero apico-lateral interaktioner mellan ependymala och B1 celler inkluderar tight junctions och zonula adhaerens ^5,12. Dessutom adhesionsmolekyler som är inblandade i de junctionala komplex mellan B1 och ependymala celler, såsom N-cadherin och V-CAM, har visat att reglera inte bara den mycket organiserad positionering av B1 i V-SVZ nisch, men också deras quiescence ^{12 13.} Det ependymala-B1 cellmonoskiktet tycks verka som en diffusionsbarriär som tillåter den reglerade flödet av vatten och små molekyler från CSF, men begränsar den intercellulära passagen av stora proteiner ^10,11. Experimentella bevis indikerar att en unik position B1 cell apikala cilium skulle kunna spela en roll som en sensor av signalering polypeptider förekommer i cerebrospinalvätskan ^2,5-7. Ependymala celler är i sig också en källa av lösliga och membranbundna signaler med en roll i regleringen av NSC beteende ^14,15.

Spårbara nukleosider, såsom brom-deoxiuridin (BrdU) eller retrovirus har använts i stor utsträckning för att märka progenitorceller, inklusive NSCs, in vivo. Men dessa metoder inte är optimala för långsiktig öde spårning eftersom BrdU signaler späd genom upprepade celldelningar och retrovirus verkar företrädesvis rikta gående förstärkning celler på grund av deras krav på celltillväxt för transduktion ^16,17. För att undersöka NSC fysiologi in vivo, inklusive interaktion med nischkomponenter, är det viktigt att fastställa en metod för att märka och spåra sällan delande celler, som B1-NSCs är i stort sett stilla och deras grann ependymala celler delar aldrig under fysiologiska förhållanden ^3. Här visar vi att lentivirala vektorer (LVs) möjliggöra högeffektiv gen märkeing och långsiktig modifiering av vuxna NSCs och icke-delande ependymala celler, på grund mest rimligt att deras förmåga att transducera och att integrera in i genomet hos målceller i en cellcykeloberoende sätt. Dessutom visar vi hur rutten för leverans och virustiter hjälp att specifikt transducera ependymala celler, men inte B1 celler vilket möjliggör analysen av nischberoende, ependymala effekter på NSCs.

Protocol

ETIK ANALYS: Detta protokoll följer riktlinjerna för djurskötsel vid universitetet i Valencia i enlighet med EU-direktiv 2010/63 / EU. 1. Framställning av LV för in vivo-märkning studier (se figur 1a) VARNING: Det förfarande som beskrivs häri är skyddsnivå 2, därför utföra alla följande procedurer i en biologiskt huva. Se till att forskningspersonalen är lämpliga kvalifikationer och utbildning i alla förfaranden. Använd personlig skyddsutrustning, inklusive k…

Representative Results

LV-medierad gen leveranssystem kan användas för att på lång sikt in vivo transduktion av celler i vuxen mus V-SVZ, vilket gör att deras spårning och genetisk modifiering under proliferation, migration och differentiering. Infektionen och uttrycket är mycket effektiva och ger ett stort antal celler som lätt kan urskiljas bland andra icke-infekterade celler genom uttryck av reportern ingår. Hittills har vi visualiserat transducerade celler med GFP fluorescerande reportrar, som drivs av den ubiquitously u…

Discussion

LVs erbjuder viktiga fördelar jämfört med andra virala system för genetisk modifiering av vuxna NSCs ^16,18. Stereotaktisk leverans av lentivirus till V-SVZ nisch representerar en effektiv metod för att märka och spåra sällan dela B1-NSCs övervinna begränsningarna i andra vanligen använda metoder såsom BrdU, som späds efter flera celldelningar, eller retrovirus, som bara målceller som breder vid tidpunkten för ansökan. LVs, tillsammans med adenovirus kan infektera celler oberoende av deras cyke…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations