A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.
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Artigo de método
Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imunidade adaptativa é regulada por interações dinâmicas entre as células T e células apresentadoras de antígenos ('APCs') conhecido como 'sinapses imunológicas. Dentro destas interfaces de célula-célula íntimos agrupamentos sub-celular discretas de MHC / Ag-TCR, F-actina, adesão e moléculas de sinalização formar e remodelar rapidamente. Essas dinâmicas são pensados para ser determinantes críticos tanto da eficiência e qualidade das respostas imunes que se desenvolvem e, portanto, de proteção contra a imunidade patológica. Compreensão atual das sinapses imunológicas com fisiológico APCs é limitado pela inadequação da resolução de imagem obtidos. Embora modelos substrato artificial (por exemplo, bicamadas lipídicas planas) oferecem excelente resolução e têm sido ferramentas extremamente valiosas, eles são inerentemente não-fisiológica e simplista. As células endoteliais vasculares e linfáticas surgiram como um tecido periférico importante (ou estroma) compartimento de "semi-profissãoai APCs '. Estas APCs que expressam (a maioria da maquinaria molecular de APCs profissionais) têm a característica única de formação da superfície celular praticamente plana e são facilmente transfectáveis (por exemplo, com os repórteres de proteína fluorescente). Aqui uma abordagem básica para implementar as células endoteliais como uma nova e fisiológico "planar modelo celular da APC 'para melhorar a imagiologia de interrogação e de processos fundamentais de sinalização antigénicos irá ser descrito.
Introdução
Os linfócitos T são um ramo do sistema imunitário adaptativo, caracterizado por a capacidade de reconhecer eficientemente antigénio peptídico (Ag) ligado ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) através dos seus receptores de células T (TCRs) 1. Linfócitos naive constitutivamente migrar e digitalizar 'Ag células apresentadoras de profissionais "(APCs; por exemplo, células dendríticas) dentro de gânglios linfáticos, enquanto as células de memória / T efetoras precisa fazer um levantamento efetivamente uma gama extremamente ampla de APCs e células alvo em potencial dentro tecidos periféricos.
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Protocolo
Todas as experiências descritas neste protocolo são realizadas com células T humanas primárias e células humanas primárias disponíveis comercialmente endoteliais (dérmica ou microvascular pulmonar ECs) protocolo de pesquisa .any envolvendo seres humanos deve ser aprovado por um conselho de revisão institucional e consentimento informado por escrito deve ser fornecida a partir de cada doador de sangue. Experimentos conduzidos utilizando este protocolo foi aprovado pelo IRB do Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparar as células CD4 + Th1 Humano Effector / T de memória
- Aplicar torniquete no braço do doador, limpe veia com álcool, e....
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Resultados
Uma nova abordagem de imagem usando células endoteliais e que combina as vantagens de resolução do cartão planar bicamadas lipídicas modelo com a complexidade fisiológica e deformabilidade da APC profissional foi desenvolvido (Figura 1). A Figura 2 proporciona exemplos de migração típica, fluxo de cálcio e dinâmica topológica observada com este abordagem. Na ausência de retracção no endotélio, os linfócitos T CD4 + Th1 SAg específicos espalhar.......
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Discussão
No geral, este protocolo descreve métodos para a investigação de células endoteliais como i) APCs fisiológicos pouco estudado e ii) como um novo tipo de "modelo APC celular planar". Com relação ao primeiro, tornou-se cada vez mais apreciado que APCs não hematopoiéticas periférica (ou 'estromais') desempenham papéis, não redundantes críticos (ou seja, em comparação com hematopoiéticas APCs) na formulação de respostas imunes adaptativas 16-18. Entre tais "semi-profissional" .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Peter T. Sage por sua ajuda na geração de algumas das imagens representativas. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para C.V.C. (HL104006).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Torniquete sem látex elástico BD | Biosciences BD Biosciences | 367203 | |
| Cotonetes com álcool BD | Biosciences | BD Biosciences 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 |
| EDTA BD Vacutainer Conjunto de coleta de sangue com botão de pressão | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Traga para RT antes |
| de usar FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| enterotoxina estafilocócica | B Toxina Tecnologia | BT202RED | Solução de estoque 1mg / ml em PBS |
| toxina da síndrome do choque tóxico 1 | Tecnologia de toxinas | TT606RED | Solução de estoque 1mg / ml em |
| PBS IL-15 humano | R & D Systems | 247-IL-025 | Solução de estoque 50ug / ml em PBS |
| PBS Life Technologies | 10010-049 | ||
| Fibronectina | Life Technologies | 33016-015 | Solução de estoque 1mg / ml em H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Outros ECs microvasculares humanos podem ser usados, ou seja, HLMVECs |
| EGM-2 MV kit de bala | Lonza | CC-3202 | |
| Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Solução de estoque 10x, diluída em PBS |
| amaxa-HMVEC-L Kit de nucleofector | Lonza | vpb1003 | Kit necessário para a etapa 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Solução de estoque 1mg/ml em H20 |
| TNF-alfa 10ug, Human | Life Technologies | PHC3015 | Solução de estoque 1mg/ml em fenol H20 |
| HBSS sem vermelho | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Cloreto | de Cálcio Sigma-Aldrich | C1016-100G | Solução de estoque 1M em H20 |
| Cloreto | de magnésio Sigma-Aldrich | 208337 | Solução de estoque 1M em H20 |
| Albumina de soro humano | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F óleo de imersão livre de fluorescência | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Solução de estoque 1mM em DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (DsRed citoplasmático solúvel) | Clontech | 632466 | |
| pDsMembrana de monômero vermelho (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Faloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Solução de formaldeído 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Tóxico, use capela |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML& | |
| nbsp; Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 15mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 50mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Frascos Tratados com Cultura de Tecidos Falcon T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Frascos Tratados com Cultura de Tecidos Falcon T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Lamínulas de vidro | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm de diâmetro |
| Placas de Cultura de Tecidos Falcon 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Placas Delta-T | Bioptechs | 04200415B | |
| Pipetas Pasteur Descartáveis Wheaton | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 camundongo anti-humano | BD Biosciences | 555509 | |
| camundongo HS1 camundongo anti-humano | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purificado | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Classe II anticorpo | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 anticorpo | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta anticorpo | Abcam | ab109481 | |
| fosfotirosina (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Eletroporador necessário para o passo 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Série 60) Armário de Segurança Biológica | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 ° C, 5% CO2 Incubadora de Cultura | de Células Centrífuga Fisher Scientific | 202370 | |
| 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocitômetro | Sigma-Aldrich | Z359629 | Hemocitômetro Bright-Line |
| Isotemp Banho-maria modelo 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
Referências
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L.
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Reimpressões e permissões
