Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics
Summary
Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.
Abstract
Immunità adattativa è regolata da interazioni dinamiche tra cellule T e cellule presentanti l'antigene ('APC') denominati «sinapsi immunologica. All'interno di queste interfacce cellula-cellula intime discrete sub-cellulari cluster di MHC / Ag-TCR, F-actina, adesione e molecole di segnalazione si formano e rimodellano rapidamente. Queste dinamiche si pensa siano fattori determinanti sia per l'efficienza e la qualità delle risposte immunitarie che sviluppano e quindi di protezione contro l'immunità patologica. Attuale comprensione delle sinapsi immunologiche con fisiologica APC è limitata dalla inadeguatezza della risoluzione delle immagini ottenibili. Anche se i modelli substrato artificiale (ad esempio, doppi strati lipidici planari) offrono un'eccellente risoluzione e sono stati strumenti estremamente utili, essi sono intrinsecamente non-fisiologica e semplicistica. Cellule endoteliali vascolari e linfatiche sono emersi come un importante tessuto periferico (o stromale) Vano di 'semi-professionaleAl APC '. Questi APC (che esprimono la maggior parte del macchinario molecolare di professionisti APC) hanno la caratteristica unica di formare superficie cellulare praticamente piana e sono immediatamente transfectable (ad esempio, con i giornalisti proteina fluorescente). Qui un approccio di base per l'attuazione cellule endoteliali come un romanzo e fisiologica 'planare modello APC cellulare' per migliorare l'imaging e l'interrogazione dei processi di segnalazione antigeniche fondamentali sarà descritto.
Introduction
Linfociti T sono un ramo del sistema immunitario adattativo caratterizzato dalla capacità di riconoscere efficientemente antigene peptide (Ag) vincolato al complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) molecole attraverso i recettori delle cellule T (TCR) 1. Linfociti naïve costitutivamente migrano e Scan 'Ag cellule presentanti professionali »(APC, ad esempio, cellule dendritiche) all'interno dei linfonodi, mentre le cellule di memoria / T effettrici devono sorvegliare efficacemente una gamma estremamente ampia di APC e potenziali cellule bersaglio all'interno dei tessuti periferici.
Nel min seguente iscrizione iniziale delle cognate Ag su un APC, linfociti arrestare la loro migrazione e cominciano a formare un professionista intimo un'interfaccia cellula-cellula chiamato 'sinapsi immunologica' (IS). Sostenuta (cioè, 30-60 min) È contatti sono tenuti per amplificare e sostenere segnalazione 2-7. Studi emergenti identificano che all'interno della IS, è la formazione continua e rapida remodeling di discrete segnalazione sub-cellulare micro-cluster (ad esempio, contengono MHC / Ag-TCR, F-actina, adesione e molecole di segnalazione), che determinano la forza e la qualità della conseguente risposta immunitaria 2-7. Tuttavia, i dettagli dinamici e meccanismo di regolazione di questo processo non sono completamente compresi 8,9. Ciò deriva in gran parte da problemi tecnici connessi con topologie irregolari di superfici APC e l'orientamento mal controllata dei piani di interazione cellula-cellula, i problemi che limitano profondamente imaging spazio-temporale richiesto avvicina 8-10 (Figure1A).
Figura 1. Una fisiologica Planar APC cellulare Modello for Imaging immunologiche Synapse Dynamics. Lo schema mostra l'imaging tradizionale di sinapsi immunologica tra una cellula T e un professio nal APC (A) e cellule T e un modello tradizionale lipidico planare doppio strato APC (B) rispetto a questo romanzo endoteliale modello planare APC (C). APC professionali forniscono sinapsi immunologiche fisiologiche ma offrono interfaccia mal orientata cellula-cellula (cioè, rispetto al piano ottimale di imaging xy; risoluzione ~ 0,2 micron), che compromette notevolmente spaziale (piano di imaging z risoluzione ~ 1 micron) e temporale (cioè, a causa della necessità di eseguire la scansione ripetutamente attraverso tutti i piani di imaging z) Risoluzione di imaging. Modelli a doppio strato hanno una topologia planare che fornisce la risoluzione ottimale delle immagini spazio-temporale, ma sono anche molto semplificate, non fisiologica e rigida. Questo modello delle cellule endoteliali combina la topologia planare di doppi strati lipidici con il substrato fisiologico di un classico APC per fornire la risoluzione ottimale di imaging spaziale e temporale in un ambiente fisiologico.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il lavoro precedente ha parzialmente aggirato questi ostacoli attraverso lo sviluppo di modelli di substrato planare (ad esempio, doppi strati lipidici e superfici rivestiti con anticorpo) che forniscono la risoluzione spazio-temporale ottimale (cioè, mediante il fissaggio alla superficie di attivazione delle cellule T in un unico piano che è parallelo al di imaging ottimale xy piano) 11-15 (Figura 1B). Questi modelli hanno facilitato importanti conoscenze sulle dinamiche subcellulari / molecolari che controllano la segnalazione antigenico nelle cellule T, tra cui la scoperta di actina dinamico / TCR segnalazione micro-cluster 7,11-14. Tuttavia, tali modelli sono intrinsecamente avevano semplificato, così come rigida (precludendo sviluppo / studio delle caratteristiche topologiche 3-dimensionali) (Figura 1B). Pertanto, rimane incerto su come relazionarsi tali risultati al PHYsiologic cellula-cellula sorveglianza immunitaria.
Sebbene ancora poco studiato, vascolari e cellule endoteliali linfatiche stanno emergendo come un grande (vale a dire, maggiore in numero rispetto a tutti APC professionali, da ~ 1.000 volte) compartimento periferico di 'semi-professionale' APC 16-18. Queste cellule esprimono MHC-I-, MHC-II e una moltitudine di molecole co-stimolatore (ad esempio, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, ma non CD80 e CD86) e sono strategicamente posizionato all'interfaccia sangue tessuto in cui servono le funzioni di sentinella specializzate 16-18. Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule endoteliali possono effettivamente ri-stimolare effettori / memoria, ma non ingenua, le cellule T 19-25. Così, le cellule endoteliali sono suscettibili di svolgere ruoli unici APC in fase effettrice delle risposte immunitarie adattive all'interno dei tessuti periferici, come ad esempio l'influenza locale all'attivazione delle cellule T, la differenziazione, la memoria e la tolleranza 16,17,26. Criticamente, quando coltivate in vitro, le cellule endoteliali formano superfici cellulari praticamente piane e sono immediatamente transfectable (ad esempio, con i reporter proteina fluorescente). Queste caratteristiche sono ideali per imaging ad alta risoluzione spazio-temporale delle dinamiche topologiche durante le interazioni cellula-cellula 19,27. Così le cellule endoteliali potrebbe servire come 'cellulare planare APC' modello fisiologico distintamente adatto per lo studio dei meccanismi di rimodellamento sottocellulari / molecolare che guidano riconoscimento dell'antigene e regolano le risposte (Figura 1C) 19,20.
Precedentemente stabilito tecniche di imaging complementari (comprese trasfezione di cellule endoteli con accessori proteina fluorescente della membrana plasmatica e citosol) per studiare i dettagli di interazione leucociti-endotelio durante adesione e migrazione transendoteliale 27, hanno mostrato che i leucociti sondare attivamente superficie dell'endotelio dalla dinamica l'inserimento di und retrazione del sub-micron-scala, sporgenze cilindriche ricco di actina (~ 200-1.000 nm di diametro e profondità) definito invadosome-come sporgenze (vale a dire, 'ILPS') 27,28. Questi approcci di imaging sono state ulteriormente espansa insieme alla creazione di protocolli di sfruttare funzione endoteliale APC per sviluppare i primi metodi per un'alta risoluzione spazio-temporale della cellula endoteliale sinapsi immunologica T come riportato 19,20 e ulteriormente descrivere qui. Un risultato centrale derivato da questo romanzo planare cellulare modello APC è che ILPS cellule T funzionano sia nel promuovere il riconoscimento iniziale Ag e nel sostenere la successiva segnalazione. In effetti, gli array di più ILPS (che sono stati stabilizzati e maturati in risposta alla prima flusso di calcio) spettacolo di arricchimento in TCR e molecole suggestivi della segnalazione attiva tale PKC-Q, ZAP-70, phosphotyrosine e HS1. Pertanto, ILPS sembrano rappresentare un equivalente fisiologica tridimensionale al micro TCR segnalazionecluster visto in modelli doppio strato planari. Questo approccio, quindi, sensibilmente rivela / report dinamica molecolare e architettonici (e implicite biomeccanica) non altrimenti rilevabile.
Il metodo qui descritto dovrebbe essere utile per colmare il divario tra APC professionali e modelli substrato artificiale APC, al fine di migliorare la nostra capacità di interrogare meccanismi di base della risposta immunitaria adattativa. Mentre qui l'attenzione è sull'attivazione di CD4 + di tipo Th1 effettore / cella di memoria, questo approccio di base può essere facilmente modificato per studiare una vasta gamma di tipi di cellule T e Ags, come discusso di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel complesso, questo protocollo descrive i metodi per indagare le cellule endoteliali come i) understudied APC fisiologici e ii) come un nuovo tipo di 'planare cellulare modello APC'. Per quanto riguarda il primo, è diventato sempre più apprezzato che APC non ematopoietiche periferiche (o 'stromali') svolgono, un ruolo non ridondanti critici (ad esempio, rispetto a ematopoietiche APC) nel modellare le risposte immunitarie adattive 16-18. Tra tali 'semi-professionale' APC, v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).
Materials
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
Referências
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