उच्च Throughput<em> देनियो rerio</em> ऊर्जा व्यय परख
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
Zebrafish zebrafish ऊर्जा homeostasis और मोटापे के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से लागू मॉडल बनाने की क्षमता है कि निहित लाभ के साथ एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव हैं। भ्रूण पर assays के एक 96 या 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में आयोजित किए जाने के लिए zebrafish के छोटे आकार की अनुमति देता है, morpholino और CRISPR आधारित प्रौद्योगिकियों स्नान आवेदन द्वारा आनुवंशिक हेरफेर में आसानी, और नशीली दवाओं के उपचार को बढ़ावा देने के लिए व्यवहार्य है। इसके अलावा, zebrafish उपन्यास जीन की खोज की अनुमति के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए आदर्श होते हैं। मोटापे के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish के रिश्तेदार नवीनता को देखते हुए, यह पूरी तरह से इन लाभों का फायदा उठाने के लिए उपकरण विकसित करने के लिए आवश्यक है। इस के साथ साथ, हम एक साथ भ्रूण zebrafish के हजारों की संख्या में ऊर्जा व्यय को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। हम अलग-अलग मछली को अलग-थलग करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग, जिसमें एक पूरे जानवर microplate मंच का विकास किया है और हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल संस्कृति व्यवहार्यता फिर से का उपयोग कर संचयी एनएडीएच 2 उत्पादन का आकलनएजेंट alamarBlue। Poikilotherms में एनएडीएच 2 उत्पादन और ऊर्जा व्यय के बीच संबंधों को कसकर जुड़ा हुआ है। यह ऊर्जा व्यय परख तेजी से सीधे ऊर्जा व्यय को बदलने या एक आवेदन दवा (जैसे इंसुलिन sensitizers) के जवाब में परिवर्तन है कि औषधीय या आनुवंशिक जोड़तोड़ स्क्रीन करने के लिए संभावित बनाता है।
Introduction
माउस वर्तमान में मोटापा अनुसंधान के लिए प्रमुख मॉडल है। लघु पीढ़ी अंतराल और माउस में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की तारीख करने के लिए बेजोड़ किया गया है। हालांकि, zebrafish भी एक छोटी पीढ़ी अंतराल है (3-4 महीने) और आनुवंशिक हेरफेर 1,2 के आराम में भी माउस से बढ़कर है। अब तक आनुवांशिक और दवा स्क्रीन 3 में उपयोग के लिए वंश और संभावित की संख्या में माउस से अधिक है, जबकि zebrafish, स्तनधारी जीन का लगभग 90% का कहना है।
मोटापे में पढ़ाई के लिए zebrafish मॉडल की क्षमता का दोहन करने के लिए, assays के ऊर्जा व्यय सहित शरीर के वजन विनियमन, को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच करने के लिए विकसित किया जाना चाहिए। चयापचयों β ऑक्सीकरण और tricarboxylic एसिड चक्र ऑक्सीजन के माध्यम से कार्रवाई कर रहे हैं के रूप में सेवन किया जाता है और NADH 2 उत्पादन किया जाता है। इस प्रकार, एनएडीएच 2 चयापचय मार्ग (मेटाबोलाइट ऑक्सीकरण) के माध्यम से चयापचयों के प्रवाह का एक सीधा संकेत है। Poikil मेंhomeotherms 4 की तुलना में 5 गुना कम – otherms, एच + एटीपी संश्लेषण से एनएडीएच 2 ऑक्सीकरण uncouples 4 है जो भीतरी mitochondrial झिल्ली के माध्यम से रिसाव। तदनुसार, zebrafish एनएडीएच में 2 बहुत कसकर ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पादन से जुड़ा हुआ है। इस के साथ साथ, हम ऊर्जा व्यय 5 के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में लार्वा zebrafish में एनएडीएच 2 उत्पादन उपाय है कि एक परख का वर्णन है।
आक्सीजन की खपत ऊर्जा व्यय को मापने के लिए स्वर्ण मानक है। फिर भी, सबसे अच्छा zebrafish के उच्च throughput क्षमता का लाभ लेने के लिए, ऊर्जा व्यय के assays के उच्च throughput के लिए उत्तरदायी होना चाहिए। सिस्टम घूम एक बंद कक्ष पर निर्भर करती है कि ऑक्सीजन की खपत सिस्टम 6 उपलब्ध कक्षों की संख्या से throughput में सीमित हैं। खुली हवा ओ 2 खपत / सीओ 2 उत्पादन assays भी zebrafish 5,7 में लागू किया गया है। ये खुली हवा में 96 अच्छी तरह से थाली आधारविकास सिस्टम उच्च throughput के लिए उत्तरदायी हैं। दुर्भाग्य से, पर्यावरण के साथ गैस विनिमय इन परीक्षणों की संवेदनशीलता को सीमित करता है। हमने हाल ही में रेडोक्स सूचक alamarBlue 5 का उपयोग कर एनएडीएच 2 पर नज़र रखता है कि एक परख के आवेदन को प्रकाशित किया। इस परख throughput और zebrafish में ऑक्सीजन की खपत के विश्लेषण के लिए आम संवेदनशीलता में सीमाओं पर काबू।
zebrafish पूरे शरीर को ऊर्जा homeostasis के अध्ययन के लिए एक तेजी से महत्वपूर्ण मॉडल बनता जा रहा है। भाग में, zebrafish क्योंकि आगे आनुवंशिक स्क्रीन और दवा स्क्रीन में उपयोग करने के लिए उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, पछाड़ना और दस्तक, जल्दी से लागू किया जा सकता सहित आनुवंशिक हेरफेर को निशाना बनाया। हम पहले इस परख यौगिकों और चयापचय दर 5 बदल कि जीन की पहचान करने के लिए स्नान दवा आवेदन और आनुवंशिक पछाड़ना या पीटकर के साथ जोड़ा जा सकता है कि पता चला है। इसके अलावा, इस परख zebrafish के लिए निहित उच्च throughput लाभ का फायदा उठाने के लिए बनाया गया है। </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरिया या कवक के साथ प्रदूषण को बहुत इस परख के आवेदन सीमित कर देगा। E3 भ्रूण माध्यम में methylene नीले फंगल संक्रमण की संभावना को सीमित करता है। भ्रूण के दौरान यह ध्यान दो बार प्रत्येक दिन मृत भ्रूण को दूर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A practical approach. , (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
