Nøyaktig og Fenol Gratis DNA sexing av Dag 30 svinekjøtt embryoer ved PCR

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

Forskning på prenatal programmering i grisen har vist at kjønn på utvikling av embryo eller foster kan påvirke utviklings utfallet. Derfor er det nødvendig muligheten til å bestemme et embryo er sex i mange eksperimenter spesielt om tidlig utvikling. Den foreliggende protokoll demonstrerer en billig, rask og ikke-toksiske fremstilling av gris genomisk DNA for bruk med PCR. Dag 30 embryo må humant samles i henhold til retningslinjer fastsatt av Institutional Animal politikk og velferdskomiteer for denne protokoll. Fremstillingen av hele embryoet for denne PCR-basert sexing teknikk innebærer ganske enkelt å slipe den frosne embryo til et fint pulver ved anvendelse av en pre-avkjølt morter. PCR-kvalitet DNA frigjøres fra en liten mengde av embryo pulver ved å bruke en varm inkubasjon i en alkalisk lyserings reagens. Deretter blir DNA-løsning blandet med nøytralisering buffer og anvendt direkte for PCR. To primerpar genereres til Detect spesifikk kjønn bestemmelse region av Y-kromosom (SRY) og ZFX region av X- kromosom med høy nøyaktighet og spesifisitet. Det samme protokollen kan brukes på andre langstrakte embryoer (dag 10 til dag 14) tidligere enn dag 30. I tillegg kan denne protokollen gjennomføres med 96-flommet plater når screening et stort antall embryoer, noe som gjør det mulig for automatisering og høy gjennomstrømming sex skrive.

Introduction

Den gris har blitt en grunnleggende forskning fag i utvikling, genetikk og ernæring i både menneskelige og husdyr sektorer. Potensialet av griser som biomedisinske modeller for human forskning kan tilskrives deres fysiologiske likheter. I husdyr, kan manipulering av kjønnsfordelingen forsterke virkningen av seleksjon og genetisk forbedringsprogrammer ^1. Sexing individuelle embryo er et grunnleggende verktøy som brukes i mange eksperimentelle undersøkelser inkludert men ikke begrenset til genotype, epigenetikk og X inaktivering av kjønnsdimorfisme under tidlig embryoutvikling ^2.

Studier på mus tyder på at mors kosthold og andre faktorer kan føre til kjønnsubalansen ^tre. I griser, årsaker til sex ratio ubalanse inkluderer faderlig rase ^4, livmor kapasitet ^5, og purka metabolske tilstand ^6. Siden forskjellene observert i embryoer og kull kan være påvirket av seg selvxual dimorphism, bør forskerne være oppmerksom på embryo sex og kjønnsfordelingen før trekke konklusjoner om deres forskning. Utviklingen av effektive verktøy og protokoller for sexing gris embryo på dag 30 av utbyggingen vil bli diskutert her.

Forskjellige metoder for sex typing har blitt utviklet for genetiske studier i modellorganismer og husdyr. Spesielt i husdyr, identifisere mannlige og kvinnelige tidlige embryoer er en svært vanlig praksis å forbedre genetisk seleksjon for avlsprogram. Tidlig embryo karyotypering i gris ved hjelp Giemsa ⁷ eller intens fluorescens ^8,9 teknikker har blitt brukt for sex skrive. Men disse fremgangsmåter er tidkrevende og ikke egnet for screening av et stort antall embryoer raskt og nøyaktig.

Den mest effektive sex skrive metoden er DNA-amplifikasjon ved anvendelse av en varmestabil DNA-polymerase og et par av primere. DNA sexing ved hjelp av PCR-metoden er mer spesifikk, rask og følsom, oare som krever en liten mengde av cellulære materialer. Den første PCR-basert embryo sexing ble utført på mennesker ^10, og senere i mus ^11, storfe ^12, bøffel ¹³ og sau ¹⁴ pre-implantasjon embryoer. I gris, ble den tidligste DNA-typing kjønn metode etablert for pre-implantation embryo via et enkelt par av Y-kromosom spesifikk DNA-primere ^15. Imidlertid var de mest vanlige PCR-primere for kjønnsbestemmelse valgt fra Y-kromosomet av mannlig spesifikk SRY gen ¹⁶ og den ikke-kjønn diskriminerende område av et sink-finger-genet lokalisert på både X- og Y-kromosom ^17. Senere har disse primere er anvendt for å bestemme kjønn på dag 30 embryoer i denne studien med forbedret spesifisitet av primerne for å detektere bare X- kromosomet til en sink-finger-genet.

Genomisk DNA fra svin pre-implantasjon embryo kan hentes ut ved å utsette et intakt blastocyst til buffer med proteinase K ¹⁶ eller ved å ta en biopsi av noen få celler fra den individuelle tidlig spalting embryoer ¹⁵ og ved hjelp av dem for direkte PCR. Men utgivelsen av DNA fra svin blod, hår, vev eller et stort Conceptus over noen få centimeter i størrelse er ikke effektivt gjøres ved hjelp av proteinase K-metoden. DNA ekstraksjonsmetoder for disse materialene er etablert ved hjelp av enten tidkrevende fenol / kloroform protokoller ⁶ eller dyrt kolonne basert kits ^18. For å unngå bruk av potensielt toksiske kjemikalier, er det en tendens til å utvikle billige, enkle og fenol-fri DNA-ekstraksjonsmetoder. Denne type av protokoll for isolering av PCR-kvalitet genomisk DNA fra mus ¹⁹ og sebrafisk ²⁰ vev har blitt etablert ved hjelp av varmt natriumhydroksyd og Tris (hotshot). Denne studien gir en protokoll for å få DNA med modifiserte hotshot og redesignet duplex primerpar for PCR sex skrive direkte fra cellelysater av Day 30 svin embryoer medhøy nøyaktighet.

Protocol

I samsvar med den kanadiske Rådet for dyrestell retningslinjer og med godkjenning av fakultetet Animal Policy and Welfare Committee – Oppdrett av University of Alberta, ble gravide purker avlivet av opplært staber på ca dag 30 av svangerskapet og embryoer ble samlet. Bruk eksamen hansker hele tiden under prosedyrene. 1. Prøvetaking og prøveoppbevaring Avlive purke hjelp fange bolt fulgt av blodtapping. Bruk undersøkelseshansker for å samle den reproduktive traktater og embryoer fra hver avlives…

Representative Results

Et representativt resultat av kjønnsbestemmelse fra 345 DNA-lysater screening ved PCR er vist i figur 7 og oppsummert i tabell 1. Som det kan ses på figur 7, er primerne glødetemperaturen ved 65 ° C er den optimale tilstand i denne PCR-protokollen generere lik intensitet og betinget amplikon størrelser (figur 5)</…

Discussion

De fleste av de eksisterende protokoller svin embryoer DNA sex typing er bare egnet for tidlig pre-implantasjon scenen ^15,16. Vi har utviklet en protokoll egnet for svin embryo screening sent i svangerskapet. Basert på studier med liknende utviklingsstadier av embryoer fra tidligere studier ^6,18, er den foreliggende protokoll anses å være sikrere og lave kostnader.

Denne protokollen er også egnet for et stort antall prøver for sex skrive ved hjelp av PCR ved overf?…

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.