במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Summary

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Abstract

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

Introduction

methyltransferase Phosphatidylethanolamine אנזימים (PEMT) לזרז את הקובץ המצורף קוולנטיים של קבוצות מתיל אחד או יותר באמצעות -adenosylmethionine S (SAM) כתורם קבוצה מתיל על PE, monomethyl-PE או דימתיל-PE לתת monomethyl-PE, דימתיל-PE ו / או phosphatidylcholine (PC). אנזימים אלה הם כמעט בכל מקום בתאים של בעלי חיים ופטריות. ניתן גם למצוא אותם בכמה צמחים ¹ וכ -10% מחיידקים, במיוחד אלה שאינטראקציה עם אאוקריוטים ^2.

PEMTs רלוונטי לביולוגיה של התא לא רק על ידי תרומה לייצור של מחשב, אשר הוא ברמת שומנים בדם העיקרית בתאים של בעלי חיים, אלא גם על ידי מילוי תפקודים תאיים חשובים נוספים. ביונקים, PEMTs באים לידי ביטוי בעיקר בכבד שבו הם נדרשים להפרשה נורמלית של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד, והם גם תורמים להשמנה יתר הנגרם דיאטה ^3, טרשת עורקים ^4, ואינסולין להתנגדאהה ^5. בנוסף, PEMT יונקים גם באו לידי ביטוי בתאי שומן, אם כי לרמות נמוכות יותר, ולהשתתף בתצהיר שומן ^{6, 7.} תפקיד PEMT בהתפתחות סרטן ^{8, 9} אפופטוזיס, ^{ו- 10} צמיחת תאים גם הוכח. בחיידקים, אנזימי PEMT הוכחו להיות חשוב לצמיחה נורמלית של תאי ^2, ארסיות ^2, וסימביוזה עם צמח המארח ^11.

המטרה והרציונל של הפרוטוקול הנוכחי הוא למדוד פעילות PEMT מתמציות תא שלמות ללא הצורך לטהר את האנזים. שני פרוטוקולים שונים פותחו כדי למדוד את פעילות PEMT. אחד הראשון והנפוץ ביותר מודד את העברת קבוצה מתיל tritiated מSAM רדיואקטיבי על PE, אשר הוא הנושא של מאמר זה. פרוטוקול זה פותח במקור כדי למדוד את פעילות PEMT משמרים ¹² ותאי יונקים (כבד) ¹³ כדי לקבל understanding של ביוסינתזה מחשב בתאים אלה, כמו גם כדי לקבוע את הספציפיות של אנזימים אלה. מאוחר יותר, בטכניקה זו יושמה לסוגי תאים אחרים, כגון חיידקים ² (באמצעות ערך ה- pH בסיסי עבור assay למרות ¹⁵⁾ וטפילי protozoan ^14. טכניקה זו יכולה לשמש עם תמציות תא שלמות, כמו גם אנזים מטוהר, וניתן ליישם פוטנציאלי לכל מערכת תמצית תא. Assay רדיואקטיבי שאינו גם תוכנן שמסתמך על הכימות האנזימטית של -adenosylhomocysteine ​​S, מוצר transmethylation של SAM ^16. Assay האחרון עשוי להיות נוח יותר כפי שהוא אינו כרוך בקרינה רדיואקטיבית, אבל זה מתאים רק לאנזימים מטוהרים.

Protocol

הכנת תמצית 1. תא לגדול תאי שושנת יריחו בבקבוק סטרילי פלסטיק האטומים עם כובע הדוק אוויר ב 26 מעלות צלזיוס במדיום עשוי 1x M199 בתוספת 20 מ"מ HEPES pH7.4, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / ?…

Representative Results

איור 1 מציג assay PEMT התלוי זמן, שבוצע עם תמצית כל תא שושנת יריחו כמקור אנזים באמצעות PE אנדוגני כמצע. כמות הרדיואקטיביות בשלב האורגני הייתה לכמת ידי ספירת נצנץ. מספרים וכתוצאה מכך נוצלו כדי לחשב את הסכום של קבוצות מתיל tritiated מועברות על גבי PE…

Discussion

assay זה פשוט, מהיר PEMT מאפשר כימות של צורות מפוגלים של PE שנובע מהעברה של קבוצות מתיל רדיואקטיביים מSAM על PE באמצעות תמצית תא כולו כמקור חלבון. הוא מהיר, רגיש, לשחזור, ומתאים גם לאנזימים מטוהרים ^17. ניתן להוסיף Monomethyl- או דימתיל-PE לassay אם methyltransferase של עניין הוא ספציפי למצע…

Materials

S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	dilute it fresh
Glass beads, acid washed, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic acid solution	Sigma Aldrich	B9643
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	C2284
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrophotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock solution (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillation liquid	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C