Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MicroRNAs sind als neue therapeutische Targets aufgrund ihrer universellen Rolle bei der Regulation der Genexpression und direkte Beweise für die Beteiligung an der Krankheit entstanden. MiRNAs werden aktiv auf ihr Potenzial untersucht, wie Drogen-Ziele 1,2. Ferner werden Veränderungen der miRNA-Expression mit verschiedenen Krankheiten 3 und Simulation dieser Veränderungen durch künstliche Störung der miRNA-Expression verbunden sind, können verwendet werden, um die zelluläre Signalwege in Krankheitsmanifestation beteiligt untersuchen. Gewebespezifische Lieferung von miRNA gezielt Medikamente ist derzeit eine der größten Herausforderungen für die miRNA-basierte Wirkstoffentwicklung. Antagomirs und miRNA-Mimetika sind vielversprechend Mittel zum Stören miRNA Ebenen 4-6. Spezielle Funktionen, die ihre Spezifität und Wirksamkeit erhöhen, weisen jedoch in der Gestaltung der Antagomirs eingebaut werden, bevor sie für die in vivo Störung der miRNA-Expression verwendet werden.
MicroRNAs sind besonders relevant, als Ziele in derzeit unheilbaren neurodegenerativen und neuroentwicklungs Krankheiten. Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine Beschränkung für die Lieferung von Antagomirs im Gehirn. Stereotaktische Injektionen sind weit verbreitet in Nagetiermodellen verwendet werden, um Moleküle an bestimmten Stellen im Gehirn 7 zu liefern. Es erfordert Geschick, umfangreiche Investitionen in der Instrumentierung und Zeit. Stereotaktische Injektionen sind invasive, umfassen Chirurgie, führen zumindest leichten Verletzungen und an lokale Auslieferung beschränkt. Die Verwendung von Zelldringenden Peptide mit einer Vorliebe für die Ausrichtung Neuronen können diese Einschränkungen zu begegnen, da sie durch die trans-Kreislauf-Strecke geliefert werden, sondern durchbrechen die Bluthirnschranke. Solch ein Peptid aus der Rabies Virus Glycoprotein (RVG) abgeleitet ist, wurde zuvor verwendet, um siRNA gegen Japanische Enzephalitis-Virus bei Mäusen 8 zu liefern. Wir haben festgestellt, dass unter Verwendung des Peptids für Antagomir Lieferung, miRNAs kann wirksam sein niedergeschlagen im Gehirn der Maus 9.
NHALT "> Die zweite große Herausforderung der miRNA knock-down ergibt sich aus der geringen Größe der miRNAs und das Vorhandensein von eng verwandten Sequenz Isoformen. Wir nehmen das Beispiel des MMU-miR-29-Familie, die aus drei eng verwandte Isoformen besteht, miR-29a , b und c. Antagomire sind auch allgemein entlang der Hauptkette modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen und machen sie beständig gegenüber Nukleasen angreifen. Locked Nucleic Acids (LNAs) bieten einen weiteren Vorteil, dass sie verbessern die thermische Stabilität und sogar dazu führen, um den Abbau über und jenseits Ziel sterische Hinderung. 10 Einführung Änderungen entlang der Hauptkette kann wirksam, aber teuer sein. Wir haben bereits gesehen, daß Modifikationen über eine optimale Anzahl kann nicht weiter die Wirksamkeit. Die Gestaltung des antagomir beinhaltet daher die optimale Änderung der antagomir.Um die komplexen Antagomir nicht-kovalent mit dem neurotropen Peptid, einem geladenen Hepta- zu nona-Arginin-Erweiterung verwendet wird. D-ArgininRückstände werden verwendet, da sie eine höhere Stabilität zu verleihen, da sie nicht anfällig für eine Spaltung durch Proteasen. Hepta- zu nona-Arginin Strecken wirken als effiziente Zellpenetrationsmittel, obwohl sie Behandlungen nicht die Zelltyp-Spezifität. Durch kovalente Verknüpfung der RVG-Peptid an die nona-Arginin-Linker, einem neurotropen, Zelle eindringende Peptid generiert wurde. Die positiv geladenen Reste des Peptids in Wechselwirkung mit der negativ geladenen Nukleinsäure Rückgrat, um Komplexe zu bilden. Diese Komplexe können verwendet werden, um DNA oder RNA effektiv transfizieren in kultivierten Zellen und in vivo in das Gewebe wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Outro | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
Referências
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