Lingettes nasal pour la grippe détection d'un virus et l'isolement des porcs

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Surveillance des virus de l'influenza A chez le porc est essentielle à la santé humaine et animale en raison de la grippe A virus évolue rapidement dans les populations de porcs et de nouvelles souches sont continuellement en train d'émerger. Porcine sont en mesure d'être infecté par diverses lignées de virus influenza A qui les rend hôtes importants pour l'émergence et le maintien de la nouvelle grippe A souches de virus. L'échantillonnage des porcs dans divers contextes tels que les fermes commerciales porcs, les foires agricoles et les marchés d'animaux vivants est important de fournir une vue complète des souches actuellement en circulation IAV. L'ante-mortem technique d'échantillonnage de l'étalon-or actuel (collecte des écouvillons nasaux) est un travail intensif car il nécessite la contention physique des porcs. Lingettes nasales impliquent frotter un morceau de tissu à travers le groin du porc avec peu ou pas de retenue de l'animal. Le nasale essuyer procédure est simple à réaliser et ne nécessite pas de personnel avec vétérinaire ou de formation professionnelle de la manipulation des animaux. Wien que légèrement moins sensibles que les écouvillons nasaux, les taux de détection de virus et d'isolement sont suffisants pour faire nasale essuie une alternative viable pour l'échantillonnage de porcs individuels lorsque les méthodes d'échantillonnage faible de stress sont nécessaires. Le protocole de procédure décrit les étapes nécessaires pour recueillir une nasale viable essuyer d'un porc individuel.

Introduction

Les virus grippaux A (IAV) provoquent des maladies respiratoires chez de nombreuses espèces, y compris les oiseaux domestiques, les porcs et les humains. En raison de réassortiment du génome IAV segmenté évolution virale rapide peut se produire et de nouvelles souches IAV sortir fréquemment. Les porcs sont une espèce qui peut servir comme une cuve de mélange pour réassortiment des IAV d'espèces hôtes multiples. ¹ Il existe actuellement trois principaux sous-types de l'IAV couramment circulant chez les porcs en Amérique du Nord (H1N1, H1N2, H3N2), mais de multiples introductions de VIA de l'homme ont a conduit à une vaste diversité IAV au sein de ces sous-types. ² évolution rapide des IAV infectant les porcs a été évidente depuis 1998 quand un triple réassorti IAV contenant des segments de gènes provenant de virus humain, aviaire et porcine ³ est répandue chez les porcs aux États-Unis. ⁴ Le gène interne segments de cette triple réassorti IAV restent très fréquente chez IAV infectant actuellement porcine. ⁵

"> Dans le monde entier, l'IAV est une cause importante de maladie respiratoire chez les porcs présentant des signes cliniques typiques comprennent la fièvre, anorexie, léthargie, toux, respiration laborieuse, les éternuements, l'écoulement nasal et le gain de poids insuffisant. IAV peut être particulièrement coûteux pour semer fermes où la reproduction échec en raison de la fièvre induite IAV et de porcelets chétifs-né ont été documentés. ^6,7 Aux États-Unis, l'IAV est couramment détectée dans les troupeaux de porcs commerciaux et la diversité antigénique et génomique étendue et l'évolution continue entre IAV porcine infecter a entravé le contrôle de cette virus. ^11/08

Santé Les préoccupations du public au sujet de l'émergence d'une souche IAV pandémie résultant d'un réassortiment chez le porc ont été réalisé en 2009 quand un IAV porcine lignée contenant des segments de gènes de la lignée porcine nord-américaine triple réassorti et la lignée porcine aviaire de type eurasien causé une pandémie mondiale chez les humains. ¹² Le virus pandémique (A (H1N1) pdm09) a depuisréassorti avec des porcs souches endémiques IAV ^13,14 et certaines de ces nouvelles souches ont été réassortis transmis en retour à l'homme. ¹⁵ La fréquence des événements réassortiment et émergence de nouvelles souches IAV à potentiel pandémique rend la surveillance active des virus circulant chez les porcs IAV impératif, en particulier à l'interface de porc-humain.

L'interface de la peste humaine est important pour bi-directionnel de la transmission interespèces de l'IAV. Human-à-porcine transmission se produisant dans la production porcine commerciale est responsable d'une grande quantité de IAV diversité actuellement présent dans la population porcine. Les foires agricoles sont les plus grands paramètres de la mêlage des personnes et des porcs aux États-Unis et sont des sites pour la transmission zoonotique de l'IAV. ^15-21 En 2012 connus, lors de l'épidémie de variante H3N2 IAV, 93% des cas signalés à la fréquentation une foire agricole dans les jours précédant l'apparition de la maladie. ¹⁵ L'analyse génomiquedes isolats viraux provenant de porcs d'exposition par rapport aux isolats humains confirmé transmission zoonotique. porcine ²¹ Exposition infectés par IAV souvent ne présentent pas de signes cliniques de la maladie, ^21-23 indiquant la nécessité de tests de diagnostic directs.

L'échantillonnage des porcs visiblement malades ne suffira pas à réussir à identifier la prévalence IAV chez les porcs et ne peut être invoquée pour identifier de nouvelles souches de l'IAV émergents parmi les porcs. La surveillance active est absolument nécessaire pour la détection des souches émergentes de l'IAV chez le porc et d'évaluer leur menace à la fois pour les porcs et la santé publique. La plupart des activités de surveillance IAV sont volontaires et donc des méthodes peu perturbateurs sont nécessaires. Les trois principales procédures de prélèvement d'échantillons ante mortem pour IAV infecter les porcs sont: écouvillons nasaux, des fluides oraux, et les lingettes nasales. Les recommandations actuelles pour échantillonner porcine individuelle pour détecter liste IAV l'insertion de fibres synthétiques écouvillons dans les narines comme la méthode préféréepour recueillir les sécrétions nasales et les cellules épithéliales. ^24,25 Parce que les porcs peuvent essayer d'éviter cette procédure, une équipe de personnel qualifié doit retenir porcs soit manuellement ou avec un piège en fonction de la taille de l'animal. ²⁶ Le processus de retenue est laborieuse pour le personnel et stressant pour les porcs. En outre, l'exposition des porcs sont souvent impliqués dans plusieurs compétitions à une foire de sorte que la perception de stress supplémentaire sur un animal de la concurrence peut faire propriétaires résistant aux efforts de surveillance.

Avec probabilités de détection IAV allant de 80-100% dans IAV troupeaux infectés, fluides oraux sont devenus une alternative populaire aux écouvillons nasaux pour la détection moléculaire de l'IAV dans les populations de porcs. ^27,28 De plus, les fluides oraux peut offrir une fenêtre plus large de détection IAV que écouvillons nasaux après l'infection initiale. Cependant, l'isolement de l'IAV fluides oraux a été problématique avec seulement 50% des tentatives d'isolement du virus entraînant IAV récupération. ²⁹

Utilisation de lingettes nasales en lieu et place des écouvillons nasaux cours de la surveillance chez les porcs IAV surmonte les limitations décrites ci-dessus. Lingettes nasales ne nécessitent pas l'utilisation d'un piège de retenue et peuvent être effectuées sans stresser les animaux ou les témoins de la procédure. Formation technique minimale est nécessaire pour recueillir des lingettes nasales, ce qui permet aux professionnels non-vétérinaires, y compris les propriétaires de porcs, de recueillir les échantillons de surveillance. Lingettes nasaux ont été précédemment par rapport aux écouvillons nasaux pour la détection et l'isolement des virus de la grippe A et le ³⁰ protocole détaillé pour cette méthode non invasive d'échantillonnage est décrite ci-dessous.

Protocol

Tous les porcs utilisés pour la collecte des données suivantes ont été protégés en vertu de la Commission institutionnelle soin et l'utilisation des animaux Ohio State University (utilisation animale numéro de protocole 2009A0134-R1). 1. Préparation de transport viral moyen de prélèvement des échantillons et flacons Ajouter 37 g de Brain Heart Infusion à 900 ml d'eau purifiée et bien mélanger avec une barre d'agitation et d'agitateur magnétique tout …

Representative Results

L'utilisation réussie de cette méthode donne des résultats RRT-PCR qui, accompagnée de l'utilisation d'un contrôle interne lors de l'extraction de l'ARN et RT-PCR, montrent des échantillons ne contiennent des inhibiteurs de PCR de tout débris de l'environnement ramassé lors de l'échantillonnage. Après inoculation échantillon, puits d'isolement du virus devraient être libres de débris de l'environnement visible de l'échantillon. Il ya un accord raisonnable entre les r…

Discussion

Prélèvement d'échantillons provenant de porcs en utilisant des écouvillons nasaux polyester pointe est avéré utile dans la conduite de la surveillance IAV; Cependant, l'utilisation de la procédure de l'écouvillon nasal entrave les efforts de surveillance en raison de l'utilisation obligatoire de un piège à la retenue. Lingettes nasales représentent un raffinement des techniques porcine actuelles d'échantillonnage pour minimiser le stress sur les personnes et les porcs lors de la collecte …

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
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