Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Overvåking for influensa A-virus i svin er avgjørende for menneskers og dyrs helse fordi influensa A-viruset utvikler seg raskt i svinepopulasjoner og nye stammer er stadig voksende. Svin er i stand til å bli smittet av ulike linjer av influensa A-virus som gjør dem viktige verter for fremveksten og vedlikehold av ny influensa A virusstammer. Prøvetaking griser i ulike innstillinger, for eksempel kommersielle svinegårder, landbruksmesser, og levende dyr markeder er viktig å gi et helhetlig syn på tiden sirkulerer IAV stammer. Dagens gullstandard ante mortem sampling teknikk (dvs. samling av nasale vattpinner) er arbeidskrevende fordi det krever fysisk beherskelse av grisene. Nasal våtservietter innebærer å gni et stykke stoff på tvers av snuten på gris med minimal til ingen beherskelse av dyret. Nese tørk Fremgangsmåten er enkel å utføre og krever ikke personell med profesjonell veterinær eller dyrehåndtering trening. While litt mindre følsom enn nasale vattpinner, virus deteksjon og isolasjon priser er tilstrekkelig til å gjøre nasal tørker av et levedyktig alternativ for prøvetaking individuelle griser når lavt spenningsprøvetakingsmetoder er påkrevd. Den fortsetter protokollen beskriver fremgangsmåten for å samle en levedyktig nasal tørke fra en enkeltperson gris.

Introduction

Influensa A-virus (IAV) forårsake luftveissykdom hos mange arter, inkludert boliger fugler, svin og mennesker. Grunnet reassortment av segmentert IAV genomet raske viral evolusjon kan oppstå og nye IAV stammer ofte dukke opp. Svin er en art som kan tjene som en blandebeholder for reassortment av IAVs fra flere vertsarter. ¹ Det er for tiden tre store undergrupper av IAV ofte sirkulerer blant nordamerikanske svine (H1N1, H1N2, H3N2), men flere IAV innledninger fra mennesker har førte til omfattende IAV mangfold innenfor disse subtypene. ² Rapid utviklingen av IAVs infiserer svin har vært tydelig siden 1998 da en trippel reassortant IAV inneholder gensegmentene fra menneskelig, avian og svin virus ^tre ble utbredt blant griser i USA. ⁴ Den interne genet segmenter fra at trippel reassortant IAV fortsatt svært utbredt blant IAVs tiden infiserer svin. ⁵

"> På verdensbasis er IAV en vesentlig årsak til luftveissykdom hos svin der typiske kliniske tegn inkluderer feber, anoreksi, slapphet, hoste, tung pust, nysing, rennende nese og dårlig vektøkning. IAV kan være spesielt kostbart å så gårder der reproduktiv svikt på grunn av IAV indusert feber og svake fødte grisunger har blitt dokumentert. ^6,7 I USA, er IAV vanligvis påvises i kommersielle svinebesetninger og omfattende antigene og genomisk mangfold og fortsetter utviklingen blant IAV infiserer svin har hemmet kontroll over dette virus. ^8-11

Folkehelse bekymringer om fremveksten av en pandemi IAV belastninger som følger reassortment i svine ble realisert i 2009 da et svin-avstamning IAV inneholder gensegmentene fra trippel-reassortant nordamerikanske svine avstamning og den eurasiske avian lignende svin avstamning forårsaket en verdensomspennende pandemi hos mennesker. ¹² pandemisk virus (A (H1N1) pdm09) har sidenreassorted med endemisk svine IAV stammer ^13,14 og noen av disse nylig reassorted stammer har blitt sendt tilbake til mennesker. ¹⁵ Hyppigheten av reassortment hendelser og fremveksten av nye IAV stammer med pandemisk potensial gjør aktiv overvåking av sirkulerende IAV virus i svin viktig, spesielt på svin-menneskelig grensesnitt.

Svine-menneskelig grensesnitt er viktig for toveis arts overføring av IAV. Human-til-svin overføring forekommer i kommersiell svineproduksjon er ansvarlig for en stor mengde av IAV mangfold for tiden er til stede i svin populasjonen. Landbruket messer er de største innstillingene for å blande sammen av mennesker og svin i USA, og er kjent nettsteder for zoonotiske overføring av IAV. ^15-21 I 2012, under utbruddet av en variant H3N2 IAV, 93% av tilfellene rapporterte deltakelse på en landbruksmesse i dagene før utbruddet av sykdommen. ¹⁵ Genomisk analyseav virale isolater fra utstillings griser sammenlignet med menneske isolater bekreftet zoonotisk girkasse. ²¹ Utstilling svine infisert med IAV ofte ikke viser kliniske tegn på sykdom, ^21-23 indikerer behovet for direkte diagnostiske tester.

Prøvetaking av synlig syke griser alene vil ikke lykkes å identifisere utbredelsen IAV i svin og kan ikke brukes som grunnlag for å identifisere nye stammer av IAV vekst blant svin. Aktiv overvåking er helt nødvendig for påvisning av nye stammer av IAV i svin og til å vurdere sin trussel for både svin og folkehelse. De fleste IAV overvåkingsaktiviteter er frivillig og derfor minimalt forstyrrende metoder er nødvendig. De tre store ante mortem sample samling prosedyrer for IAV infiserer svin er: nasale vattpinner, spytt og nasal våtservietter. Gjeldende anbefalinger for prøvetaking enkelte svine å oppdage IAV liste innsetting av syntetisk fiber tipped vattpinner inn i neseborene som den foretrukne metodeå samle nasale sekreter og epitelceller. ^24,25 Fordi griser kan også forsøke å unngå denne fremgangsmåten, et lag av trenet personell må holde griser enten manuelt eller med en snare, avhengig av størrelsen på dyret. ²⁶ Det fastholdende prosessen er arbeidskrevende for personell, og stressende for griser. I tillegg er utstillingen svine ofte involvert i flere konkurranser på en rettferdig og det oppfattes av ekstra stress på en konkurranse dyr kan gjøre eierne motstandsdyktig mot overvåkningstiltak.

Med sannsynligheten for IAV deteksjon alt fra 80-100% i IAV infiserte besetninger, har spytt blitt et populært alternativ til nasal vattpinner for molekylær deteksjon av IAV i populasjoner av svin. ^27,28 tillegg spytt kan gi et bredere vinduet IAV deteksjon enn nasale vattpinner følgende første infeksjonen. Imidlertid har IAV isolert fra spytt vært problematisk med bare 50% av virusisolering forsøk resulterer i IAV utvinning. ²⁹

Bruke nese våtservietter i stedet for nesespinner under IAV overvåking i svineovervinner begrensningene som er beskrevet ovenfor. Nese våtservietter krever ikke bruk av en begrensende snare og kan utføres uten å stresse dyrene eller vitner til prosedyren. Minimal teknisk trening er nødvendig for å samle nese kluter, noe som gjør at ikke-veterinær fagfolk, inkludert svine eiere, for å samle overvåkingsprøver. Nese våtservietter ble tidligere i forhold til nese vattpinner for påvisning og isolering av influensa A virus ^{30 og} detaljert protokoll for denne ikke-invasiv metode for prøvetaking er beskrevet nedenfor.

Protocol

Alle svine brukes i innsamling av følgende data ble beskyttet i henhold The Ohio State University Institutional Animal Care og bruk Committee (animalsk bruk protokollnummer 2009A0134-R1). 1. Utarbeidelse av Viral Transport Medium og prøvetaking Ampuller Legg 37 g Brain Heart Infusion til 900 ml med renset vann og blandes godt med en rørestav og magnetrører under oppvarming til 70 ° C for å løse opp pulveret. Autoklaver kokes ved 121 ° C i 15 min. Cool på benken …

Representative Results

Vellykket bruk av denne metode gir RRT-PCR-resultater som, sammen med bruk av en intern kontroll i løpet av RNA-ekstraksjon og RRT-PCR, viste prøvene ikke inneholder PCR-inhibitorer fra en hvilken som helst miljømessig rusk plukket opp under prøvetaking. Etter prøve-inokulasjon, bør virusisolering brønner være fri for synlig miljømessig avfall fra prøven. Det er rimelig samsvar mellom RRT-PCR resultater og virus isolasjons resultater med den forståelse at PCR gir ofte en høyere IAV positiv rate enn virus iso…

Discussion

Samle prøver fra griser ved hjelp av polyester-tipped nasale vattpinner har vist seg nyttig i å gjennomføre IAV overvåking; Men bruken av nesepinne prosedyren hindrer overvåking innsats på grunn av den nødvendige anvendelse av en snare for tilbakeholdenhet. Nese våtservietter representerer en videreutvikling av dagens svine sampling teknikker for å redusere stress på mennesker og griser under prøvetakingen. Mens metoden er utviklet for og validert i utstillingen svin innstillinger, kan det være lett brukes t…

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Nitrile Exam Gloves	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)