Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Vigilância de vírus da gripe A em suínos é fundamental para a saúde humana e animal, porque o vírus influenza A evolui rapidamente em populações de suínos e novas estirpes estão surgindo continuamente. Suínos são capazes de ser infectado por diversas linhagens do vírus influenza A, tornando-os anfitriões importantes para o surgimento e manutenção da nova gripe A estirpes de vírus. Amostragem suínos em diversas configurações, como granjas comerciais de suínos, feiras e mercados agrícolas, de animais vivos é importante para fornecer uma visão abrangente das cepas que circulam atualmente IAV. O ante-mortem técnica de amostragem padrão-ouro atual (ou seja, coleta de swab nasal) é trabalhoso porque exige contenção física dos porcos. Toalhetes nasais envolvem esfregando um pedaço de tecido em todo o focinho do porco com o mínimo de retenção do animal. A nasal limpe procedimento é simples de executar e não requer pessoal com formação profissional ou veterinária manipulação animal. While ligeiramente menos sensível do que swab nasal, as taxas de detecção e isolamento do vírus são suficientes para fazer nasal limpa uma alternativa viável para a amostragem de suínos individuais quando são necessários métodos de amostragem de baixa tensão. O protocolo de processo descreve as etapas necessárias para coletar uma nasal viável limpe a partir de um porco individual.

Introduction

Os vírus influenza A (IAV) causam doenças respiratórias em muitas espécies, incluindo aves domésticas, suínos e seres humanos. Devido ao rearranjo da evolução viral rápida segmentado genoma IAV pode ocorrer e novas cepas IAV frequentemente surgem. Suína são uma espécie que pode servir como um recipiente de mistura para rearranjo de iAVS a partir de múltiplas espécies hospedeiras. ¹ Atualmente, existem três principais subtipos de IAV normalmente circulam entre os porcos da América do Norte (H1N1, H1N2, H3N2), mas várias introduções IAV de seres humanos têm levou a extensa diversidade IAV dentro desses subtipos. ² evolução rápida da iAVS infectam suínos tem sido evidente desde 1998, quando um recombinante triplo IAV contendo segmentos de genes de vírus humanos, aviários e suínos ³ tornou-se difundido entre os porcos nos Estados Unidos. ⁴ O gene interno segmentos de que IAV recombinado triplo permanecem altamente prevalente entre iAVS atualmente infectando porcos. ⁵

"> Em todo o mundo, IAV é uma importante causa de doenças respiratórias em suínos em que os sinais clínicos típicos incluem febre, anorexia, letargia, tosse, dificuldade para respirar, espirros, corrimento nasal e pouco ganho de peso. IAV pode ser particularmente caro para semear fazendas onde reprodutiva falha devido a febre IAV induzida e leitões fracos-nascido foram documentados ^6,7. Nos Estados Unidos, IAV é comumente detectada em rebanhos suínos comerciais e extensa diversidade antigênica e genômica e evolução contínua entre IAV suína infectar tem dificultado o controle deste vírus ^8-11.

Preocupações de saúde pública sobre a emergência de uma estirpe IAV pandemia resultante do rearranjo em suínos foram realizados em 2009, quando um IAV suína-linhagem contendo segmentos de genes da linhagem suína norte-americana triple-reassortant e da linhagem suína aviária do tipo Eurasian causou uma pandemia mundial em humanos ^12. A pandemia do vírus (A (H1N1) pdm09), desde então,rearranjado com suínos endêmica IAV estirpes ^13,14 e algumas destas estirpes recentemente rearranjado foram transmitidos de volta para os seres humanos. ¹⁵ A freqüência de eventos de rearranjo e surgimento de novas cepas IAV com potencial pandêmico faz a vigilância ativa de vírus circulando IAV em suínos imperativo, especialmente na interface suína-humano.

A interface suína-humano é importante para a transmissão bi-direcional interespécies do IAV. Humano-a-suína transmissão que ocorrem na produção suína comercial é responsável por uma grande quantidade de diversidade IAV actualmente presente na população de porcos. Feiras agrícolas são os maiores configurações para o comingling de pessoas e suína nos Estados Unidos e são locais para a transmissão zoonótica do IAV ^15-21. Em 2012 conhecido, durante o surto de uma variante H3N2 IAV, 93% dos casos relatados no atendimento uma feira agrícola nos dias ¹⁵ Análise Genômica antes do início da doença.dos isolados virais de suínos de exposição em comparação com isolados humanos confirmaram transmissão zoonótica. suína ²¹ Exposição infectado com IAV muitas vezes não mostram sinais clínicos da doença, ^21-23, indicando a necessidade de testes de diagnóstico diretos.

Amostragem de suínos visivelmente doente por si só não irá identificar com sucesso prevalência IAV em suínos e não pode ser invocado para identificar novas cepas de IAV emergentes entre suína. A vigilância ativa é absolutamente necessário para a detecção de estirpes emergentes da IAV nos suínos e para avaliar sua ameaça tanto para suínos e de saúde pública. A maioria das actividades de fiscalização do IAV são voluntárias e, portanto, são necessários métodos minimamente perturbadoras. Os três principais procedimentos de coleta de amostra ante-mortem para IAV infectar suínos são: swab nasal, fluidos orais e nasais toalhetes. As actuais recomendações para a amostragem suína indivíduo para detectar a inserção lista IAV-de fibra sintética com ponta cotonetes nas narinas como o método preferidopara recolher secreções nasais e células epiteliais. ^24,25 Porque os porcos podem tentar evitar este procedimento, uma equipe de pessoal treinado deve conter suínos manualmente ou com um laço, dependendo do tamanho do animal. ²⁶ O processo de contenção é trabalhoso para o pessoal e estressante para os porcos. Além disso, exposição suína estão freqüentemente envolvidos em várias competições em uma feira de modo a percepção de stress em um animal de competição pode fazer proprietários resistente aos esforços de vigilância.

Com probabilidades de detecção IAV que variam de 80-100% em IAV rebanhos infectados, fluidos orais tornaram-se uma alternativa popular para nasal swabs para a detecção molecular do IAV em populações de suínos. ^27,28 Além disso, líquidos orais podem fornecer uma janela mais ampla de IAV detecção de swab nasal após a infecção inicial. No entanto, IAV isolamento a partir de fluidos orais tem sido problemática com apenas 50% das tentativas de isolamento de vírus, resultando em IAV recuperação. ²⁹

Usando toalhetes nasais em vez de swab nasal durante a vigilância IAV em suínos supera as limitações descritas acima. Toalhetes nasais não requerem o uso de uma armadilha de restrição e pode ser realizada sem perturbar os animais testemunhas ou do procedimento. Treinamento técnico mínimo é necessário para coletar limpezas nasais, que permite que os profissionais não-veterinários, incluindo os proprietários de suínos, para recolher as amostras de vigilância. Toalhetes nasais foram comparadas anteriormente para esfregaços nasais para a detecção e isolamento de vírus influenza A e ³⁰ do protocolo detalhado para este método não-invasivo de amostragem é descrito abaixo.

Protocol

Todos os suínos utilizados na coleta dos seguintes dados estavam protegidos sob O Comitê Animal Care Institucional e Use Ohio State University (uso de animais protocolo número 2009A0134-R1). 1. Preparação de Transporte Viral Médio e Coleta de Amostras Vials Adicionar 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de água purificada e misturar cuidadosamente com uma vareta de agitação e um agitador magnético, enquanto se aquece a 70 ° C para dissolver completamente o pó. <l…

Representative Results

A utilização bem sucedida deste método produz TRr-PCR resulta que, acompanhada com a utilização de um controlo interno durante a extracção de ARN e TRr-PCR, mostram amostras não contêm inibidores de PCR a partir de quaisquer detritos apanhados ambiente durante a amostragem. Após a inoculação de exemplo, os poços de isolamento de vírus deve ser livre de detritos ambientais visível a partir da amostra. Há um consenso razoável entre os resultados rRT-PCR e os resultados de isolamento de vírus com o entend…

Discussion

Coleta de amostras de suínos utilizando swab nasal com ponta de poliéster tem se mostrado útil para conduzir a vigilância IAV; no entanto, a utilização do procedimento de swab nasal dificulta os esforços de vigilância devido ao uso obrigatório de um laço à contenção. Toalhetes nasais representam um refinamento de técnicas de amostragem suína atuais para minimizar o estresse sobre as pessoas e suínos durante a coleta de amostra. Enquanto o método tem sido desenvolvido e validado para exposição em ambie…

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
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