Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Övervakning för influensa A-virus hos svin är avgörande för människors och djurs hälsa, eftersom influensa A-virus utvecklas snabbt i svinpopulationer och nya stammar ständigt växer fram. Svin kan infekteras av olika linjer av influensa A-virus som gör dem viktiga värdar för uppkomsten och upprätthållandet av den nya influensan A virusstammar. Provtagning svin i olika miljöer såsom kommersiella svingårdar, jordbruksmässor och levande djur marknaderna är viktigt att ge en heltäckande bild av närvarande cirkulerar IAV stammar. Den aktuella guldstandard före slakt provtagningsteknik (dvs. insamling av nasala svabbar) är arbetsintensiv eftersom det kräver fysisk begränsning av grisarna. Nasal våtservetter innebär gnugga en bit tyg över nosen av grisen med minimal eller ingen begränsning av djuret. Nasal torka förfarandet är enkelt att utföra och inte kräver personal med professionell veterinär- eller djurhantering utbildning. While något mindre känsliga än nasala svabbar, virus upptäckt och isolerings priser är tillräckliga för att göra nasala våtservetter ett lönsamt alternativ för provtagning enskilda svin när låg spänningsprovtagningsmetoder krävs. Förfarandet protokollet beskriver de steg som behövs för att samla in en livskraftig nasal torka från en enskild gris.

Introduction

Influensa A-virus (IAV) orsakar luftvägssjukdomar hos många arter, inklusive tamfåglar, svin och människor. På grund av omgruppering av den segmenterade IAV genomet rapid viral evolution kan uppstå och nya IAV stammar ofta dyker upp. Svin är en art som kan fungera som ett blandningskärl för omgruppering av IAVs från flera värdarter. ¹ Det finns för närvarande tre stora subtyper av IAV vanligt cirkulerar bland nordamerikanska svin (H1N1, H1N2, H3N2), men flera IAV introduktioner från människor har ledde till en omfattande IAV mångfald inom dessa subtyper. ² Snabb utveckling av IAVs infekterar svin har varit tydlig sedan 1998, då en trippel reassortant IAV innehållande gensegment från människa, fågel- och svinvirus ³ blev utbredd bland grisar i USA. ⁴ Den interna genen segment från den tredubbla reassortant IAV fortfarande mycket utbrett bland IAVs närvarande infekterar svin. ⁵

"> Globalt är IAV en viktig orsak till respiratorisk sjukdom hos svin i vilka typiska kliniska tecken är feber, anorexi, letargi, hosta, ansträngd andning, nysningar, nästäppa och dålig viktökning. IAV kan vara särskilt kostsamt att så gårdar där odlings fel på grund av IAV inducerad feber och svaga födda smågrisar har dokumenterats. ^6,7 Inom USA, är IAV ofta upptäcks i kommersiella svinbesättningar och omfattande antigen och genom mångfald och fortsatta utveckling bland IAV infekterar svin har försvårat kontrollen över denna virus. ^8-11

Folkhälso oro framväxten av en pandemi IAV stam följd av omgruppering hos svin genomfördes under 2009 då ett svin-härstamning IAV innehållande gensegment från trippel reassortant nordamerikanska svin härstamning och den eurasiska avian liknande svin härstamning orsakade en världsomspännande pandemi hos människor. ¹² pandemiviruset (A (H1N1) pdm09) har sedanomarrangerade med endemisk svin IAV stammar ^13,14 och några av dessa nyligen omarrangerade stammar har sänts tillbaka till människor. ¹⁵ Frekvensen av omgruppering händelser och framväxten av nya IAV stammar med pandemisk potential möjliggör en aktiv övervakning av cirkulerande IAV virus hos svin absolut nödvändigt, särskilt vid svin mänskliga gränssnittet.

Den svin mänskliga gränssnittet är viktigt för dubbelriktad mellan arterna överföring av IAV. Från människa till svin transmissionen uppträder i kommersiell svinproduktion är ansvarig för en stor mängd IAV mångfald för närvarande föreligger i svinpopulationen. Jordbruksmässor är de största inställningar för hoppass människor och svin i USA och är kända platser för zoonotiska överföring av IAV. ^15-21 Under 2012 under utbrottet av en variant H3N2 IAV, 93% av fallen rapporterade närvaro vid en jordbruksmässa i dagarna före debut av sjukdom. ¹⁵ Genomisk analysav virala isolat från utställnings grisar jämfört med humana isolat bekräftade zoonotiska sändning. ²¹ Utställnings svin infekterade med IAV ofta inte visar några kliniska tecken på sjukdom, ^21-23 indikerar behovet av direkta diagnostiska tester.

Provtagning av synligt sjuka grisar räcker inte lyckas identifiera IAV prevalensen hos svin och kan inte åberopas för att identifiera nya stammar av IAV tillväxt bland svin. Aktiv övervakning är absolut nödvändig för upptäckt av nya stammar av IAV i svin och att bedöma deras hot för både svin och folkhälsa. De flesta IAV övervakningsverksamheten är frivillig och därför behövs minimalt störande metoder. De tre stora förfaranden provtagnings före slakt för IAV infekterar svin är: nasal bomullstoppar, munvätskor och nasala våtservetter. Nuvarande rekommendationer för provtagning enskilda svin för att detektera IAV lista införandet av syntetiska fibrer tippas kompresser i näsborrarna som den föredragna metodenatt samla nasal sekret och epitelceller. ^24,25 Eftersom svin kan försöka undvika detta förfarande, ett team av utbildad personal måste hålla grisar antingen manuellt eller med en snara, beroende på storleken på djuret. ²⁶ återhållsamhet processen är arbetskrävande för personal, och påfrestande för grisar. Dessutom är utställningen svin ofta är inblandade i flera tävlingar på en mässa så uppfattningen av tillsatt stress på en tävling djur kan göra ägarna resistenta mot övervakningsinsatser.

Med sannolikheter för IAV upptäckt som sträcker sig från 80 till 100% i IAV smittade besättningar, har munvätskor blivit ett populärt alternativ till nasal bomullstoppar för molekylär detektion av IAV i populationer av svin. ^27,28 Dessutom kan munvätskor ge ett bredare fönster IAV upptäckt än nasala svabbar efter initial infektion. Emellertid har IAV isolering från munvätskor varit problematiskt med endast 50% av virusisoleringsförsök resulterar i lAV återhämtning. ²⁹

Med hjälp av nasala våtservetter istället för nasala svabbar under IAV övervakning hos svin övervinner de begränsningar som beskrivs ovan. Nasal våtservetter inte kräver användning av en återhållande snara och kan utföras utan att stressa djuren eller vittnen till förfarandet. Det krävs minimal teknisk utbildning för att samla nasala våtservetter, som tillåter icke-veterinärer, inklusive svin ägare, att samla in övervakningsprover. Nasala våtservetter tidigare jämfört med nasala svabbar för detektion och isolering av influensa A-virus ³⁰ och detaljerat protokoll för denna icke-invasiv metod för provtagning beskrivs nedan.

Protocol

Alla svin som används vid insamlingen av följande data skyddas enligt Ohio State University Institutional Animal Care och användning kommittén (djuranvändning protokoll nummer 2009A0134-R1). 1. Framställning av virustransportmedium och provsamling Flaskor Lägg 37 g Brain Heart Infusion till 900 ml renat vatten och blanda väl med en omrörarstav och magnetomrörare under upphettning till 70 ° C för fullständig upplösning av pulvret. Autoklavera buljongen vid 1…

Representative Results

Framgångsrik användning av denna metod ger rRT-PCR resultat som, tillsammans med användning av en intern kontroll under RNA-extraktion och rRT-PCR, visade proverna inte innehåller PCR-inhibitorer från eventuella miljö skräp plockas upp under provtagning. Efter prov ympning, bör virusisoleringsbrunnar vara fri från synliga miljö skräp från provet. Det är rimligt avtal mellan rRT-PCR-resultat och virusisoleringsresultat med insikten att PCR ger ofta en högre IAV positiv takt än virusisolering eftersom PCR u…

Discussion

Insamling av prover från grisar som använder polyester spets nasala svabbar har visat sig användbar vid genomförandet IAV övervakning; Men användningen av nasal kompress förfarandet hindrar övervakningsinsatser på grund av den erforderliga användningen av en snara till återhållsamhet. Nasal våtservetter utgör en vidareutveckling av nuvarande svinurvalsmetoder för att minimera stress på människor och grisar under provtagning. Medan metoden har utvecklats för och valideras i utställnings svin inställni…

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Nitrile Exam Gloves	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)