التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
المغلف النووي (NE) يفصل جبلة النواة عن السيتوبلازم. وهي تتألف من الغشاء النووي الداخلي والخارجي (الحركة الوطنية العراقية وONM، على التوالي) التي تربط في المسام النووية. ويسمى التجويف الذي رسمه كل من الأغشية مساحة محيط بالنواة (المحيطي). وONM هو امتداد الشبكة الإندوبلازمية الخشنة (ER)، والحركة الوطنية العراقية تتمسك الصفيحة النووية، كانت شبكة من النووي نوع-V خيوط المتوسطة ممثلة A- و B-نوع lamins 1،2. LInkers من Nucleoskeleton والهيكل الخلوي (لينك) المجمعات هي المجالس الجزيئات التي تمتد المغلف النووي بأكمله للاتصال جسديا داخل نواة لخيوط هيكل الخلية والمحركات الجزيئية (الشكل 1A). وهي تتألف من التفاعلات بين الزخارف الحفاظ تطويريا التي تميز عائلتين من البروتينات الغشاء لا يتجزأ من NE: الشمس (Sad1 / Unc84) البروتينات وNesprins (النووية مغلف SPectRINS). في الثدييات، Sun1 وSun2 عالبريد البروتينات عبر الغشاء من الحركة الوطنية العراقية الذي المنطقة النواة إلى الهيولى N-محطة يتفاعل مباشرة مع A- و B-نوع lamins 3-5. على الجانب الآخر من الحركة الوطنية العراقية، في الجهاز العصبي المحيطي، والبروتينات الشمس تؤوي إمتداد التطوري-حفظها من ~ الأحماض الأمينية 150 C-محطة تدعى المجال أشعة الشمس. المجالات SUN تتفاعل مباشرة مع كاش التطوري-المحفوظة (Klarsicht / حزب المؤتمر الوطني الافريقي-1، المتزامنة التماثل) المجال، توقيع الجزيئي للNesprins. تتكون المجالات كاش من امتداد ~ 30 الأحماض الأمينية-C المحطة أن يبرز في الجهاز العصبي المحيطي تليها مجال الغشاء 6. لا يقل عن أربعة جينات Nesprin مميزة (Nesprin1-4) ترميز كاش المحتوية على البروتينات التي توطين في NE 7. المناطق حشوية من Nesprins، التي تختلف أحجام من ~ 50kDa (Nesprin4) إلى مذهل 1000 كيلو دالتون (Nesprin1 العملاقة)، تحتوي على إسبكترن متعددة يكرر وكذلك الزخارف محددة تمكن تفاعلها مع مكونات هيكل الخلية مثل الأكتين، plectin والمحركات الجزيئية 8- 13.
<ص الطبقة = "jove_content"> دراسات في الفقاريات واللافقاريات أظهرت أن لامين / الأحد / Nesprin / المحركات الجزيئية تشكل "محور" الحفظ تطويريا السيطرة على الهجرة النووية ومرسى. وقد وصفت عدة طرق المغادرة (KO) نماذج الماوس من مكونات ينك معقدة وكان أساسيا في توفير إطار لفهم أدوار الشمس وNesprin البروتينات في NE خلال تطوير الثدييات 9،14،15. ولكن هذه النماذج الحالية عدة عيوب كبيرة، أبرزها: 1) صعوبة في تفسير الظواهر المقرر أن الخلية الآثار غير المتمتعة بالحكم الذاتي، 2) صعوبة في التمييز المساهمات phenotypical من كاش المحتوية مقابل كاش أقل Nesprin إيسفورمس 16، 3) التكرار وظيفية من الشمس وNesprin البروتينات في NE في العديد من أنواع الخلايا يتطلب مخططات تربية معقدة لتعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الفئران 17 و 4) من الفتك فترة ما حول الولادة من الفئران التي تعاني من نقص للكاش المجال على حد سواءNesprins1 و2 يحول دون تحليل الظواهر الكبار 18.يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر رواية تهدف إلى تعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الجسم الحي، في زنزانة بطريقة ذاتية الحكم وينظم تنمويا، وبالتالي تجاوز كثير من السلبيات المذكورة أعلاه. يعتمد هذا لجنة المساواة العرقية / القائم السلمون المدخن نموذج الفأر على مفهومين هامين: 1) المجال كاش من أي بروتين Nesprin معروفة كافية لاستهداف EGFP إلى NE في أنظمة زراعة الخلايا و2) مجالات SUN تتفاعل باباحه مع مجالات كاش، وبالتالي overexpression من وأي مجال كاش تشبع جميع المجالات SUN الداخلية ووقف نشاط المجمعات ينك بطريقة المهيمنة سلبية 17 (الشكل 1B). يصف هذا البروتوكول حصاد الأنسجة وخطوات المعالجة المستخدمة للتأكد من تعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الخلايا العصبية للدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية للدراسة بنجاح دور المجمعات ينك في الجسم الحي باستخدام (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج تيراغرام هو تحديد خط الماوس لجنة المساواة العرقية مناسب (ق). في الواقع، إن لجنة المساواة العرقية تنشط في غيرها من أنواع الخلايا المشاركة في مسارات مشابهة، يمكن أن تعقد ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا المؤلفين موظفي الصرف والتصوير الأساسية، من صميم علم الوراثة الجزيئي (قسم طب وجراحة العيون والعلوم البصرية) والفأر علم الوراثة الأساسية في جامعة واشنطن في سانت لويس مدرسة الطب. معتمدة على الكتاب من قبل برنامج المنح الصغيرة من مركز ماكدونيل لالخلوية والجزيئية بيولوجيا الأعصاب، مركز الأمل للاضطرابات العصبية، والمعهد الوطني للعيون (# R01EY022632 إلى DH)، مركز المعهد الوطني للعيون الأساسية غرانت (# P30EY002687) و منحة غير المقيد من البحوث للوقاية من العمى إلى قسم العيون والعلوم البصرية.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
Referências
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
