Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א 'וב' מסוג lamins 1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחות של חלבונים הטרנסממברני נפרד מNE: חלבוני שמש (Sad1 / Unc84) וNesprins (גרעיני המעטפה SPectRINS). ביונקים, ar Sun1 וSun2חלבונים הטרנסממברני דואר של INM שN-מסוף nucleoplasmic אזור אינטראקציה ישירות עם A- וlamins B-סוג 3-5. בצד השני של INM, בתוך PNS, חלבוני שמש נמל מתיחה שימור האבולוציוני של ~ חומצות אמינו 150 C-מסוף נקראות תחום SUN. תחומים SUN אינטראקציה ישיר עם קאש-שימור אבולוציוני (Klarsicht / Anc-1, עברו" הומולוגיה) תחום, החתימה המולקולרית של Nesprins. תחומים קאש מורכבים ממתיחה של ~ 30 חומצות אמינו C-מסוף שבולטת לתוך PNS ואחריו תחום הטרנסממברני 6. לפחות ארבעה גנים שונים Nesprin (Nesprin1-4) לקודד קאש המכיל חלבונים שלמקם בNE 7. אזורי cytoplasmic של Nesprins, הגדלים משתנים מ~ 50kDa (Nesprin4) למדהים 1,000 kDa (ענק Nesprin1), מכילים spectrin מרובה חוזר כמו גם מוטיבים מסוימים המאפשר האינטראקציה שלהם עם רכיבי cytoskeletal כגון אקטין, plectin ומנועים מולקולריים 8 13.
<class = "jove_content" p> מחקרים בבעלי חוליות וחסרי חוליות הראו כי Lamin / מנועים מולקולריים שמש / Nesprin / מהווים "ציר" אבולוציונית שימור שליטה הגירה ומעגן גרעיניים. מודלים עכבר נוק-אאוט כמה (KO) של רכיבים מורכבים LINC תוארו וסייעו במתן מסגרת להבנת התפקידים של חלבוני שמש וNesprin בNE במהלך התפתחות יונקים 9,14,15. עם זאת, מודלים אלה כמה חסרונות הנוכחיים משמעותיים, בעיקר: 1) קושי בפרשנות פנוטיפים בשל תא השפעות חד-אוטונומיות, 2) קושי בהבחנה תרומות phenotypical של קאש המכילים לעומת קאש-פחות Nesprin isoforms 16, 3) יתירות פונקציונלית של חלבוני שמש וNesprin בNE בסוגים רבים של תאים דורשת תוכניות רבייה מורכבות כדי להשבית את כל אינטראקציות SUN-קאש בעכברים 17 ו -4) קטלני סביב הלידה של עכברים החסרות לקאש-תחום של שניNesprins1 ו -2 מונעים את הניתוח של מבוגרים פנוטיפים 18.פרוטוקול זה מתאר מודל רומן עכבר נועד לשבש את כל אינטראקציות SUN-קאש in vivo, בתא אופן אוטונומי ומוסדר מבחינה התפתחותית, ובכך עוקף רב של החסרונות שתוארו לעיל. Cre / מודל עכבר מבוסס לקס זה מסתמך על שני מושגים חשובים: 1) תחום קאש של כל חלבון Nesprin ידוע מספיק כדי למקד EGFP לNE במערכות תרבית תאים ו -2) תחומים SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש, כך ביטוי יתר של כל תחום קאש יהיה להרוות כל תחומי SUN אנדוגני ולהשבית מתחמי LINC באופן דומיננטי שלילי 17 (איור 1). פרוטוקול זה מתאר קצירת רקמה ומדרגות עיבוד משמשות כדי לאשר את השיבוש של כל אינטראקציות SUN-קאש בתאי פורקינג 'במוח הקטן.
השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לצוות ליבת המורפולוגיה וההדמיה, של ליבת הגנטיקה המולקולרית (מחלקת עיניים ומדעים חזותיים) ושל עכבר הגנטיקה Core באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס בית הספר לרפואה. המחברים נתמכים על ידי תכנית המענק הקטנה ממרכז מקדונל לתאי ומולקולרית לנוירוביולוגיה, מרכז התקווה להפרעות נוירולוגיות, העין הלאומית (# R01EY022632 לDH), National Eye Institute מרכז Core גרנט (# P30EY002687) ו מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון למחלקת עיניים ומדעים חזותיים.
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |