Validering av en musmodell för att Disrupt LINC Anläggningar i en cell-specifik Manner
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
Kärnhöljet (NE) skiljer nukleoplasman från cytoplasman. Den består av en inre och yttre kärn membran (INM och ONM, respektive) som ansluter vid kärntekniska porer. Lumen avgränsas av båda membranen kallas perinukleära utrymmet (PNS). Den ONM är en förlängning av det grova endoplasmatiska retiklet (ER), och INM fäster vid kärnkrafts lamina, en meshwork av kärn typ V intermediära filament som representeras av A- och B-typ laminer 1,2. Linkers av Nucleoskeleton och Cytoskeleton (LINC) komplex är makromolekylära församlingar som spänner över hela kärnhöljet att fysiskt ansluta det inre av kärnan till cytoskelettala filament och molekylära motorer (Figur 1A). De består av interaktioner mellan evolutionärt bevarade motiv som kännetecknar två familjer av integrerade transmembranproteiner i NE: Sun (Sad1 / Unc84) proteiner och Nesprins (Nuclear kuvert SPectRINS). I däggdjur Sun1 och Sun2 are transmembranproteiner av INM vars N-terminala nucleoplasmic regionen interagerar direkt med A- och B-typ laminer 3-5. På andra sidan av INM, inom PNS, Sun proteiner hyser en evolutionär konserve sträcka av ~ 150 C-terminala aminosyrorna kallas SUN domänen. SUN-domäner interagerar direkt med den evolutionära-konserverade KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homology) domän, den molekylära underskrift Nesprins. Kash domänerna består av en sträcka av ~ 30 C-terminala aminosyror som skjuter in i PNS, följt av en transmembrandomän 6. Minst fyra distinkta Nesprin gener (Nesprin1-4) kodar KASH-proteiner som lokaliserar på NE 7. De cytoplasmiska regionerna Nesprins, vars storlek varierar från ~ 50 kDa (Nesprin4) till en häpnadsväckande 1.000 kDa (Nesprin1 jätten), innehåller flera spek upprepar samt särskilda motiv som möjliggör deras interaktion med cytoskelettala komponenter såsom aktin, plectin och molekylära motorer 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studier i ryggradsdjur och ryggradslösa djur har visat att Lamin / Sun / Nesprin / molekylära motorer utgör ett evolutionärt bevarat "axel" kontrollerande kärn migration och förankring. Flera knock-out (KO) musmodeller av LINC komplexa komponenter har beskrivits och var avgörande för att skapa en ram för att förstå rollerna som Sun och Nesprin proteiner vid NE under däggdjurs utveckling 9,14,15. Dessa modeller presentera flera betydande nackdelar, främst: 1) svårigheter att tolka fenotyper på grund av cell icke-självständiga effekter, 2) svårigheten att särskilja fenotypiska bidrag KASH-innehållande vs KASH mindre Nesprin isoformer 16, 3) funktionell redundans Sun och Nesprin proteiner vid NE i flera celltyper kräver komplexa avelsprogram för att inaktivera alla SUN-Kash interaktioner i möss 17 och 4) perinatal dödlighet hos möss med brist för KASH-domänen i bådeNesprins1 och 2 utesluter analys av vuxna fenotyper 18.Detta protokoll beskriver en ny musmodell utformad för att störa alla SOL-kash interaktioner in vivo, i en cell autonom regleras utvecklingsmässigt sätt, och därmed förbigå många av nackdelarna som beskrivs ovan. Denna Cre / lox-baserade musmodell åberopat två viktiga koncept: 1) den KASH domänen av vilken som helst känd Nesprin protein är tillräcklig för att rikta EGFP till NE i cellodlingssystem och 2) SUN domäner interagerar promiscuously med kash domäner, således överexpression av någon KASH domänen kommer att mätta alla endogena SUN domäner och inaktivera LINC komplex i en dominant-negativt sätt 17 (Figur 1B). Detta protokoll beskriver vävnads skörd och processteg som används för att bekräfta avbrott i alla SUN-Kash interaktioner i cerebellära Purkinje celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiska steget för att framgångsrikt studera betydelsen av LINC komplex in vivo med hjälp av Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modell är att identifiera en lämplig Cre mus linje (s). Faktum är att om Cre är aktiv i andra celltyper som är involverade i liknande banor, kan den försvårar tolkningen av resultaten. Därför är det viktigt att undersöka närliggande celler, så som visas här i de molekylära och granulatcellskikt i cerebellum (Figur 2B). Likaså är det viktigt att id…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar personalen på morfologi och Imaging kärna, i Molecular Genetics kärna (Ögonkliniken och Visual Sciences) och mus Genetics Kärna vid Washington University i St Louis School of Medicine. Författarna stöds av små bidrag programmet från McDonnell Centrum för Cellular och Molecular Neurobiology, Hope Center for neurologiska sjukdomar, National Eye Institute (# R01EY022632 till DH), en National Eye Institute Center Kärna Grant (# P30EY002687) och en obegränsad bidrag från Forskning kring att förebygga blindhet till Ögonkliniken och Visual Sciences.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
Referências
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
