Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Nükleer zarf (NE) Sitoplazmadan nükleolazma ayırır. Nükleer gözeneklerin bağlamak bir iç ve bir dış çekirdek zarı (INM sırasıyla Onm,) oluşmaktadır. Her iki membranlarla tarif lümen perinükleer alanı (PNS) olarak adlandırılır. Onm granüllü endoplazmik retikulum (ER) bir uzantısı olan ve INM nükleer lamina yapışır, A ve B tipi ile temsil edilen çekirdek tip V ara ipliklerin bir ağ örgüsü 1,2 lamins. Nucleoskeleton ve hücre iskeleti (LINC) komplekslerinin bağlayıcılar fiziksel iskelet ipliklerin ve moleküler motorlar (Şekil 1A) çekirdeğin iç bağlamak için bütün çekirdek zarfı kapsayan makromoleküler monte edilmiş halleridir. Güneş (Sad1 / Unc84) proteinler ve Nesprins (Nükleer Zarf SPectRINS): Bunlar KD ayrılmaz transmembran proteinlerinin iki aileyi karakterize evrimsel korunmuş motiflerinin arasındaki etkileşimleri oluşur. Memelilerde, Sun1 ve Sun2 arN-terminal bölgesi nucleoplasmic A ve B tipi lamins 3-5 ile doğrudan etkileşip etkileşmediği INM e transmembran proteinleridir. PNS içinde INM diğer tarafında, Sun proteinler 150 C-terminal amino asitler, SUN alanı adı verilen ~ evrimsel korunmamış streç barındırır. SUN etki evrimsel korunmuş Kash ile doğrudan etkileşim (Klarsicht / Anc-1, Syne Homology) etki, Nesprins moleküler imza. Kash etki, bir zar geçiş alanı 6 ve ardından PNS içine çıkıntı ~ 30 C-terminal amino asidi bir streç oluşur. En az dört farklı Nesprin genler (Nesprin1-4) NE 7 lokalize proteinler Kash içeren kodlar. Şaşırtıcı bir 1000 kDa (Nesprin1 dev) için boyutları değişir ~ 50kDa (Nesprin4) den Nesprins, sitoplazmik bölgeleri, çoklu spektrin gibi aktin, plectin ve moleküler motorlar 8- olarak iskelet bileşenleri ile etkileşimi sağlayarak tekrar yanı sıra özel motifler içeriyor 13.
<omurgalı ve omurgasız p class = "jove_content"> Araştırmalar Lamin / Güneş / Nesprin / moleküler motorlar bir evrimsel olarak korunmuş "eksen" nükleer göç ve ankraj kontrol teşkil ettiğini göstermiştir. Linc karmaşık bileşenlerin çeşitli knock-out (KO) fare modelleri tanımlanmış ve memeli gelişim 9,14,15 sırasında KD Sun ve Nesprin proteinlerinin rollerini anlamak için bir çerçeve sağlayan aracı vardı oylandı. Ancak, bu modeller en önemlisi mevcut birçok önemli sakıncaları: of fenotipik katkılarını ayırt olmayan özerk etkileri, 2) zorluk hücre nedeniyle fenotipleri yorumlarken 1) zorluk Kash-az Nesprin vs Kash içeren, 3) 16 izoformları Çok sayıda hücre tiplerinde NE Sun ve Nesprin proteinlerin işlevsel fazlalık hem Kash-etki alanı için eksik farelerde 17 tüm SUN-Kash etkileşimleri ve farelerin 4) perinatal öldürücülüğü inaktive karmaşık ıslah planları gerektirirNesprins1 ve 2 yetişkin analizi 18 fenotip engellemektedir.Bu protokol, böylece yukarıda özetlenen sakıncaları birçok atlayarak bir hücre özerk ve gelişimsel olarak düzenlenen bir şekilde de vivo tüm SUN-Kash etkileşimleri bozmak için tasarlanmış yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu Cre / lox tabanlı fare modeli, iki önemli kavramları dayanır: 1) bilinen herhangi bir Nesprin proteininin Kash alanı hücre kültür sistemlerinde KD EGFP hedef ve 2) SUN etki fazla sentezlenmesi, böylece, Kash etki alanları ile etkileşime promiscuously için yeterlidir Herhangi Kash etki tüm endojen Paz etki doyurmak ve dominant-negatif bir şekilde 17 (Şekil 1B) Linc kompleksleri inaktive edecek. Bu protokol, doku hasat ve serebellar Purkinje hücrelerinde tüm SUN-Kash etkileşimlerinin bozulması doğrulamak için kullanılan işlem adımları açıklar.
En kritik aşama başarılı Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modeli, uygun bir Cre fare hattı (ler) i belirlemek için kullanıldığı in vivo LINC komplekslerinin rolünü incelemek için. Cre içindeki yollar yer alan diğer hücre tiplerinde aktif Gerçekten de, eğer, bu sonuçların yorumunu komplike olabilir. Beyincik (Şekil 2B), moleküler ve granül hücre katmanlarında burada gösterildiği gibi Dolayısıyla, bu, at hücreleri incelemek için önemlidir. Aynı şekilde, herhangi bir fi…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar (Bölüm Göz ve Görsel Bilimler) Tıp St. Louis Okulu Washington Üniversitesi'nde Fare Genetik Core Moleküler Genetik çekirdek, Morfoloji ve Görüntüleme çekirdeğinin çalışanlarına teşekkür ederiz. Yazarlar Cellular için McDonnell Merkezi ve Moleküler Nörobiyoloji, Sinir Hastalıkları Umut Merkezi'nden küçük hibe programı tarafından desteklenen, Ulusal Göz Enstitüsü (DH # R01EY022632), Ulusal Göz Enstitüsü Merkezi Çekirdek Grant (# P30EY002687) ve Research sınırsız hibe Göz ve Görsel Bilimler Bölümü'ne Körlük Önlemek için.
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |