Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca²⁺ Aged em neurônios do hipocampo

Summary

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Abstract

Suscetibilidade a morte celular neuronal associada a neurodegeneração e isquemia são extremamente aumentada no cérebro envelhecido mas os mecanismos responsáveis ​​são mal conhecidos. A excitotoxicidade, um processo que se acredita contribuir para a lesão neuronal induzida por ambos os insultos, é mediada pela activação de receptores de glutamato que promove ^influxo de Ca2 + mitocondrial e ^sobrecarga de Ca2 +. Uma mudança substancial na homeostase intracelular ^de Ca2 + ou remodelação de ^Ca2 + intracelular homeostase pode favorecer danos aos neurônios nos neurônios velhos. Para investigar Ca ²⁺ remodelação no envelhecimento temos usado imagens de células vivas em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos que se assemelham em alguns aspectos neurônios in vivo com idade. Para este fim, as células do hipocampo são, em primeiro lugar, recém-dispersa de novas hipocampo de ratos recém nascidos e semeadas em lamelas revestido, vidro poli-D-lisina. Em seguida, as culturas são mantidas em meios controlada durante vários dias ou vários weeks para investigar jovens e velhos neurônios, respectivamente. Em segundo lugar, os neurónios em cultura são carregados com fura2 e submetido à medição da concentração citosólica ^de Ca2 + utilizando imagiologia digital de relação de fluorescência. Em terceiro lugar, neurônios cultivados são transfectadas com plasmídeos que expressam um conjunto de aequorin baixa afinidade e GFP alvejado a mitocôndria. Após 24 horas, aequorin dentro das células é reconstituído com coelenterazina e neurônios são sujeitas a imagem de bioluminescência para monitorização da concentração ^de Ca2 + mitocondrial. Este processo de três passos permite a monitorização de citosólica e respostas de Ca ²⁺ mitocondriais a estímulos relevantes como, por exemplo, o agonista do receptor de glutamato NMDA e comparar se estas e outras respostas são influenciadas pelo envelhecimento. Este processo pode produzir novos conhecimentos sobre a forma como o envelhecimento e influência citosólica ^de Ca2 + mitocondrial respostas a estímulos seleccionados, bem como o teste de fármacos seleccionados que visam prevenir células neuronaismorte em doenças relacionadas à idade.

Introduction

A excitotoxicidade é um dos mecanismos mais importantes que contribuem para o dano neuronal e morte celular em insultos neurológicos tais como a isquémia, e em algumas doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer ^1. Este tipo de neurotoxicidade é mediada principalmente pela glutamato atuação no Ca ²⁺ -permeable, receptores NMDA (NMDAR ionotrópica) ^2. A exposição de culturas de neurónios ao glutamato pode levar a excitotoxicidade ^3, o que provoca a apoptose neuronal ^4. Nós e outros autores relataram anteriormente que a vulnerabilidade neuronal para a apoptose induzida por NMDA podem mudar com o desenvolvimento in vitro e envelhecimento ^5-8.

É amplamente aceito que um aumento do free-citosólico ^{concentração} de Ca2 + ^([Ca2 +] _cit) leva à ativação de células. No entanto, se este aumento é muito elevada e / ou sustentada suficiente, pode desencadear a morte celular ^9. Além disso, foi propostoexcitotoxicity que requer Ca ²⁺ mitocondrial captação de ^10, uma vez que o tratamento de neurônios com um neurônios desacoplador mitocondrial protegidas contra a morte celular induzida pelo glutamato ^11. Se mitocôndrias ocupam muito ^Ca2 +, a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial pode ocorrer, conduzindo à libertação de citocromo c e outros factores pró-apoptóticos, e induzindo a apoptose. Mostrámos recentemente que esta absorção de ^Ca2 + mitocondrial está directamente relacionado com a sensibilidade dependente da idade à excitotoxicidade, medindo directamente induzida por NMDA mitocondrial absorção ^Ca2 + nos neurónios do hipocampo individuais ^5, um método que é relatado neste artigo. O hipocampo, envolvida em processos fisiológicos, tais como aprendizagem, memória e outros processos cognitivos ^12, é altamente vulnerável ao envelhecimento e doenças neurodegenerativas ^13. Tem sido proposto que, após várias semanas in vitro, em culturaneurônios do hipocampo mostrar uma série de características típicas de neurônios ^com 14. Assim, a longo prazo neurônios do hipocampo em cultura pode fornecer um modelo abrangente para investigar ^Ca2 + mecanismos mediados do reforço da excitotoxicidade no envelhecimento.

O objectivo geral do presente método é, por conseguinte, para investigar mudanças substanciais na homeostase intracelular ^de Ca2 + ou ^Ca2 + remodelação envelhecimento no cérebro incluindo o diferencial de Ca ²⁺ induzidos por agonistas de respostas de receptor de NMDA em um longo prazo neurónios do hipocampo em cultura . O método inclui uma descrição detalhada da cultura de neurónios de hipocampo de rato e a monitorização das concentrações citosólicas e mitocondriais Ca ²⁺ por fluorescência e imagem de bioluminescência em neurónios individuais, respectivamente. Imagiologia de fluorescência de ^Ca2 + citosólico em culturas de neurónios é um procedimento padrão. No entanto, este método é menos fiável para a subcelular ^de Ca2 + mitocondrial incluindo medições de Ca ^2+. As razões para isso incluem a falta de direcionamento adequado de sondas sintéticas e afinidade inadequado para as concentrações ^de Ca2 + que podem mudar na mitocôndria do nível mM baixa, mesmo com o nível mM. O uso de sondas de Ca ²⁺ com base em proteínas como por exemplo a aequorina, tem permitido o direccionamento para organelos subcelulares e a utilização de derivados diferentes afinidades ^de Ca2 + utilizando diferentes sondas coelenterazines ou mutadas falta Ca ²⁺ sítios de ligação específica ^15. Desta forma, a bioluminescência de imagem de células que expressam aequorin segmentada por mitocôndrias pode permitir o controlo das concentrações ^de Ca2 + mitocondrial em neurônios individuais. No entanto, este procedimento pode exigir o uso de câmeras de contagem de fótons ou câmeras CCD ultra-sensíveis para a bioluminescência de imagem ^16-18. Este método pode produzir novos resultados que devem ser confirmados em mais established modelos de envelhecimento do cérebro como, por exemplo, fatias de cérebro de animais velhos.

Protocol

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais tenham sido manipuladas em protocolos aprovados pela instalação de alojamento dos animais Universidade Valladolid de acordo com a Convenção Europeia 123 / Conselho da Europa ea Directiva 86/609 / CEE. 1. Curto e Longo prazo Cultura de Rat neurônios do hipocampo Preparação de poli-D-lisina revestido, de 12 mm de lamelas de vidro. Esterilizar 12 mm de diâmetro lamelas de vidro em etanol durante pelo menos 24 hor…

Representative Results

Aqui, descrevemos um método simples para avaliar Ca2 + remodelação e os efeitos de NMDA no citosol e mitocondrial [Ca2 +], em neurónios envelhecidos. A Figura 1 mostra o diagrama esquemático do processo para o isolamento e a cultura de neurónios de hipocampo de ratos recém-nascidos. Antes de começar, precisamos preparar estéreis, revestidos, lamelas de vidro poli-D lisina e localizá-los em um 4-bem prato. Então, ratos recém-nascidos são mortos eo cérebro removido. Ap?…

Discussion

A remodelação de ^Ca2 + intracelular homeostase no cérebro de envelhecimento tem sido relacionada à perda cognitiva, aumento da susceptibilidade à lesão isquêmica, excitotoxicidade e neurodegeneração. Para investigar esta hipótese in vitro, procedimentos de imagem Ca ²⁺ estão disponíveis. Infelizmente, culturas viáveis ​​de neurônios do hipocampo antigos não são confiáveis. Recentemente, tem-se observado que as culturas de longo prazo de neurónios de hipocampo de rato …

Materials

Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics