Subcellular सीए की प्रतिदीप्ति और bioluminescence इमेजिंग^{2 +} वृद्ध hippocampal न्यूरॉन्स में

Summary

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Abstract

Neurodegeneration और ischemia के लिए जुड़े न्यूरॉन कोशिका मृत्यु के लिए संवेदनशीलता निहायत आयु वर्ग के मस्तिष्क में बढ़ रहे हैं, लेकिन जिम्मेदार तंत्र बुरी तरह से जाना जाता है। Excitotoxicity, दोनों अपमान से प्रेरित न्यूरॉन क्षति के लिए योगदान माना एक प्रक्रिया है, सीए ² बाढ़ और माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² अधिभार को बढ़ावा देता है कि ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की सक्रियता के द्वारा मध्यस्थता है। इंट्रासेल्युलर सीए ² homeostasis के इंट्रासेल्युलर सीए ² समस्थिति या remodeling में एक बड़ा परिवर्तन पुरानी न्यूरॉन्स में न्यूरॉन क्षति एहसान कर सकते हैं। बुढ़ापे में सीए ² पुर्ननिर्माण की जांच के लिए हम इन विवो में न्यूरॉन्स के आयु वर्ग के कुछ पहलुओं में समान है कि चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की लंबी अवधि संस्कृतियों में रहते सेल इमेजिंग का इस्तेमाल किया है। इस अंत के लिए, हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं पहली जगह में, हौसले से नवजात चूहे hippocampi से फैलाया और पोली-डी lysine लेपित, कांच coverslips पर चढ़ाया, कर रहे हैं। तब संस्कृतियों कई दिनों के लिए नियंत्रित मीडिया में रखा या डब्ल्यू कई हैंक्रमशः, जवान और बूढ़े न्यूरॉन्स की जांच के लिए eeks। दूसरा, सभ्य न्यूरॉन्स fura2 के साथ भरी हुई है और डिजिटल प्रतिदीप्ति अनुपात इमेजिंग का उपयोग साइटोसोलिक सीए ² एकाग्रता के मापन के अधीन हैं। तीसरा, सभ्य न्यूरॉन्स माइटोकॉन्ड्रिया के लिए लक्षित कम आत्मीयता aequorin और GFP की एक मिलकर व्यक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं के अंदर aequorin coelenterazine साथ पुनर्गठन किया जाता है और न्यूरॉन्स माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² एकाग्रता की निगरानी के लिए bioluminescence इमेजिंग के अधीन हैं। इस तीन कदम प्रक्रिया उदाहरण के लिए ग्लूटामेट रिसेप्टर agonist NMDA और इन और अन्य प्रतिक्रियाओं उम्र बढ़ने से प्रभावित रहे हैं कि क्या तुलना के रूप में प्रासंगिक उत्तेजनाओं को साइटोसोलिक और mitochondrial सीए ² प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया कैसे प्रभाव साइटोसोलिक और mitochondrial सीए ² चयनित उत्तेजनाओं को प्रतिक्रियाओं के साथ ही न्यूरॉन सेल को रोकने के उद्देश्य चयनित दवाओं के परीक्षण उम्र बढ़ने के रूप में नए अंतर्दृष्टि उपज हो सकती हैउम्र से संबंधित बीमारियों में मौत।

Introduction

Excitotoxicity ऐसे ischemia के रूप में मस्तिष्क संबंधी अपमान में neuronal नुकसान और कोशिका मृत्यु के लिए योगदान सबसे महत्वपूर्ण तंत्रों में से एक है, और इस तरह के अल्जाइमर रोग ¹ के रूप में कुछ neurodegenerative रोगों में। न्यूरोटॉक्सिटी इस प्रकार का मुख्य रूप से सीए पर ग्लूटामेट अभिनय द्वारा मध्यस्थता है ^{2 +} पारगम्य, आइनोंट्रॉपिक NMDA रिसेप्टर्स (NMDAR) ^2। ग्लूटामेट को सभ्य न्यूरॉन्स का एक्सपोजर न्यूरोनल एपोप्टोसिस ⁴ का कारण बनता है जो excitotoxicity ^3, बढ़ सकता है। हम और दूसरों को पहले से NMDA प्रेरित apoptosis के न्यूरोनल भेद्यता इन विट्रो में विकास और ^5-8 उम्र बढ़ने के साथ बदल सकता है कि सूचना दी है।

यह व्यापक रूप से साइटोसोलिक मुक्त सीए ² एकाग्रता ([सीए ^{2 +]} _CYT) में वृद्धि की कोशिकाओं सक्रियण की ओर जाता है कि स्वीकार किया जाता है। इस वृद्धि बहुत अधिक है और / या काफी निरंतर है हालांकि, अगर यह कोशिका मृत्यु ⁹ को गति प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, यह प्रस्ताव किया गया हैकि excitotoxicity माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² तेज ^10, ग्लूटामेट प्रेरित कोशिका मृत्यु ^{11 लोगों} के खिलाफ एक माइटोकॉन्ड्रियल uncoupler संरक्षित न्यूरॉन्स के साथ न्यूरॉन्स के इलाज के बाद की आवश्यकता है। माइटोकॉन्ड्रिया सीए ² बहुत ज्यादा ऊपर ले, तो माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण ताकना के उद्घाटन साइटोक्रोम ग और अन्य समर्थक apoptotic कारक है, और उत्प्रेरण apoptosis की रिहाई के लिए अग्रणी हो सकता है। हमने हाल ही में इस माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² तेज सीधे सीधे एकल हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स ⁵ में NMDA प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² तेज, इस लेख में बताया गया है जो एक विधि को मापने के द्वारा, excitotoxicity करने के लिए उम्र पर निर्भर संवेदनशीलता से संबंधित है कि दिखाया गया है। ऐसी शिक्षा, स्मृति और अन्य संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं ¹² के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल हिप्पोकैम्पस, उम्र बढ़ने और neurodegenerative विकारों ^{से 13} अत्यधिक संवेदनशील है। यह इन विट्रो में कई हफ्तों के बाद, कि प्रस्तावित किया गया है, सुसंस्कृतहिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स आयु वर्ग के ¹⁴ न्यूरॉन्स की विशिष्ट विशेषताओं में से एक नंबर दिखा। तदनुसार, लंबी अवधि के सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स बुढ़ापे में बढ़ाया excitotoxicity के सीए ² मध्यस्थता तंत्र की जांच करने के लिए एक व्यापक मॉडल उपलब्ध करा सकता है।

प्रस्तुत विधि के समग्र लक्ष्य इसलिए, एक लंबी अवधि के सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में NMDA रिसेप्टर एगोनिस्ट से हासिल अंतर सीए ² प्रतिक्रियाओं सहित उम्र बढ़ने मस्तिष्क में intracellular सीए ² समस्थिति या सीए ² remodeling में महत्वपूर्ण परिवर्तन की जांच करने के लिए है, । विधि क्रमश: चूहे के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति का एक विस्तृत विवरण और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति और bioluminescence इमेजिंग द्वारा साइटोसोलिक और mitochondrial सीए ² सांद्रता की निगरानी भी शामिल है। सभ्य न्यूरॉन्स में साइटोसोलिक सीए ² की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एक मानक प्रक्रिया है। हालांकि, इस विधि उप लिए कम विश्वसनीय हैसेलुलर सीए माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² सहित ^{2 +} माप। इस के लिए कारण भी मिमी स्तर को कम माइक्रोन के स्तर से माइटोकॉन्ड्रिया में परिवर्तित हो सकता है कि सीए ² सांद्रता के लिए सिंथेटिक जांच के उचित लक्ष्य-निर्धारण और अनुचित आत्मीयता की कमी शामिल है। उदाहरण aequorin के लिए के रूप में प्रोटीन के आधार पर सीए ² जांच के उपयोग, subcellular अंगों का लक्ष्य रखा है और विशिष्ट सीए ² बाध्यकारी साइटों ¹⁵ की कमी अलग coelenterazines या उत्परिवर्तित जांच का उपयोग विभिन्न डेरिवेटिव सीए ² समानताएं के उपयोग की अनुमति दी है। इस तरह, माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित aequorin व्यक्त कोशिकाओं के bioluminescence इमेजिंग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए ² सांद्रता की निगरानी की अनुमति हो सकती है। फिर भी, इस प्रक्रिया bioluminescence इमेजिंग ^16-18 के लिए फोटॉन गिनती कैमरों या ultrasensitive सीसीडी कैमरों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। अधिक establ में पुष्टि की जानी चाहिए कि उपन्यास परिणाम हो सकता है इस विधिउदाहरण के लिए के रूप में दंडित मस्तिष्क उम्र बढ़ने के मॉडल, पुराने पशुओं से मस्तिष्क के स्लाइस।

Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं यूरोपीय कन्वेंशन 123 / यूरोप की परिषद और निर्देशक 86/609 / EEC के साथ समझौते में वैलेडॉलीड विश्वविद्यालय पशु आवास सुविधा द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत नियंत्रित किया गय…

Representative Results

यहाँ हम सीए 2 remodeling और साइटोसोलिक और mitochondrial पर NMDA के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन [सीए 2 +] वृद्ध न्यूरॉन्स में। चित्रा 1 को अलग-थलग और नवजात चूहों से hippocampal न्यूरॉन्स के लिए प्रक्र?…

Discussion

उम्र बढ़ने के मस्तिष्क में intracellular सीए के पुनर्गठन ^{2 +} समस्थिति संज्ञानात्मक हानि से संबंधित कर दिया गया है, इस्कीमिक क्षति, excitotoxicity और neurodegeneration के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि हुई। इन विट्रो में इस परिक?…

Materials

Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics