Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten
Summary
We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.
Abstract
Wij presenteren een techniek die in vitro tracer injectieprotocol, die gebruik maakt van een reeks elektrische pulsen en druk kleurstof opname in hersenen explantaten met gerichte laserbelichting en bijpassende filter goggles verhogen door elektroporatie tijdens de procedure combineert. De beschreven techniek van in vitro elektroporatie zelf levert relatief goede visuele controle voor het richten bepaalde hersengebieden. Door combinatie met laser excitatie van fluorescerende genetische merkers en hun uitlezing doorgaande band passeren filter bril, die halen de emissies van het genetisch gelabelde cellen / kernen en fluorescerende traceren kleurstof, een onderzoeker in hoofdzaak nauwkeurigheid van injecties vergroten door het vinden van het gebied van de rente en het beheersen van de kleurstof-spread / opname in de injectieplaats veel efficiënter. Bovendien, de laserverlichting techniek kan de functionaliteit van een bepaald neurocircuit van prov bestuderenIDing informatie over het type van neuronen projecteren op een bepaald gebied wanneer het GFP-expressie is gekoppeld aan het type zender door een subpopulatie van neuronen tot expressie.
Introduction
Om een bepaalde neuronale (micro) circuit definiëren, moet men beginnen door het vinden van de verschillende deelnemers van de schakeling, en de verbinding patroon. Sinds de publicatie Waller over neurofiber traceren door middel van laesie 1 een grote verscheidenheid van neuroanatomische tracing technieken is vastgesteld. Sommige van deze technieken kunnen in vaste weefsel post mortem 2-4 worden toegepast, andere vertrouwen op het actieve transport van de kleurstof in levende neuronen, zoals ontdekt in 1971 6/5. De laatste kunnen worden onderverdeeld in twee groepen discrimineren tussen verschillende maken van actieve retrograde (van het geïnjecteerde gebied om de bron van een bepaalde projectie, dwz. De somata van neuronen die uitsteken aan genoemde gebied) en actieve anterograde (van de geïnjecteerde gebied om de doelstelling van een bepaalde projectie, dwz. de axonale projecties en de axonale terminals van de gelabelde neuronen) vervoer. Ook in sommige gevallen tracer materiaal wordt geïnjecteerd in levende dieren die vervolgens overleven de injectie van verscheidene dagen of weken (in vivo tracer injecties), terwijl in andere gevallen geëxplanteerde hersenen geïnjecteerd en incubeer gedurende enkele uren na de injectie in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (in vitro tracer injecties) .
In dit protocol gewijzigde we een bestaand in vitro elektroporatie techniek 7-8 neuronale somata en processen labelen in anterograde en retrograde tracing experimenten met choleratoxin subunit-b en tetramethylrhodamine dextran als tracing stoffen. De algemene doelstelling van dit protocol is te neurowetenschappers te voorzien van een efficiënt hulpmiddel om neuronale connectiviteit patronen tussen verschillende hersenkernen traceren, terwijl gebruik te maken van beschikbare transgene muis lijnen en eenvoudige optische apparatuur om targeting nauwkeurigheid tijdens tracer injecties te verhogen. Hoewel de werkwijze anterograde en retrograde traceren met behulpcholeratoxin en dextran amine en hun fluorescent gemerkte conjugaten niet nieuw 9-13 (volgens de methode van elektroporatie, bijv. Haas et al. 14), de combinatie van tracer injecties met elektroporatie in een in vitro bereiding met blokken van hersenweefsel is een meer recente ontwikkeling 7. Zijn belangrijkste voordeel ten opzichte neuronale tracing technieken met dezelfde soort tracer kleurstoffen in levende dieren is de toegenomen labeling intensiteit, vanwege de hogere efficiëntie waarmee de geëlektroporeerde kleurstof wordt opgenomen door neuronen. Een bijkomend voordeel is de verkorte incubatietijd (vereist voor de kleurstof transport) en de grotere nauwkeurigheid doel tijdens de tracer injectie, omdat de experimentator visuele controle over het doelgebied van de injectie. Dit laatste betekent tevens dat geen dure stereotactische apparatuur nodig om de kern of hersengebied interessegebied.
Om addinaal verhogen targeting nauwkeurigheid, we hebben gebruik gemaakt van een transgene muis lijn, die GFP uitdrukt in zijn glycinergic subpopulatie van neuronen 15 en eenvoudige optische apparatuur, bestaande uit een hand-held laser pointer van 405 nm golflengte en bijpassende banddoorlaatfiltering goggles (450 – 700 nm). Zo behaalden we een aanzienlijke verdere stijging van de doelgerichtheid nauwkeurigheid door de injectieplaats te identificeren door middel van haar fluorescerend signaal en door een fijnere manier om te controleren voor de kleurstof verspreiding in de injectie gebied door middel van de waarneming van de interactie tussen de inheemse GFP-signaal en de tracer fluorescentie. De techniek maakt het ook mogelijk om de functionaliteit van een circuit ontdekken met de connectiviteit door het identificeren van GFP-positieve remmende neuronen (of prikkelende andere muizenlijnen) die waren gevuld met de tracer.
Kortom, we verder versterkt een krachtig instrument om de neurowetenschappelijk connectoom van de gewervelde hersenen te bestuderen en te beoordelen thij verschillende neuroanatomische kenmerken van een bepaalde neurocircuit. Met behulp van transgene muizen met goedkope en overal verkrijgbaar optische apparatuur konden we aanzienlijke verhoging van de targeting nauwkeurigheid van onze injecties. Bovendien is de transgene muizen lieten het type getraceerd verbindingen, die hielp blootleggen van de functionaliteit van een remmende microcircuit in de auditieve hersenstam identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een algemene kracht van in vitro elektroporatie tracer, in tegenstelling tot in vivo opsporen studies, is dat het onderzoekers betere toegang tot de hersenen interessegebied en dus niet duur stereotactische (vaak elektrofysiologische) materiaal omvatten. Bovendien is de overlevingsperiode nodig voor de hersenen explantaten omvat slechts een paar uur (1 – 4) in plaats van dagen of zelfs weken bij in vivo tracer injecties (zie een gedetailleerd overzicht van het gebruik van dextran aminen en and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging experimenten werden uitgevoerd aan de Universiteit van Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core mede ondersteund door NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Aantal UL1 RR025780 en de Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core Center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac van het Salk Institute gaf ons de GlyT2-GFP muizen.
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. . Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
