Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Mechanisch gevoelige cellen gebaseerde assays mogelijk maken onderzoeken hechtende cellen met een breed toepassingsgebied dat de centrale rol kunnen spelen in de mechanica celbiologie weerspiegelen. Deze toepassingen richten zich vaak op de onderliggende mechanismen die subcellulaire processen of whole-cell gedrag sturen. Enerzijds kunnen externe omgevingsfactoren zoals extracellulaire matrix samenstelling of matrix stijfheid dramatische invloed op de mechanische en biologische reactie van een cel. ¹ Hetzelfde kan worden waargenomen na toepassing van vele klassen van farmaceutisch werkzame verbindingen, waarvan de gevolgen zijn vaak gekenmerkt gebruik celkweekmodellen. ² Anderzijds genotypische eigenschappen, zoals die veroorzaakt door spontane of experimenteel geïnduceerde genetische mutaties, kunnen duidelijke veranderingen in cel fenotype die zijn geassocieerd met veranderingen in het cytoskelet structuur en functie induceren. ³ Deze voorbeelden zijn slechts enkele van de vele mogelijkeOnderwerpen waarvoor mechanische fenotypering van cellen is relevant, en al deze zijn nuttig onderzocht met MicroPOST arrays.

Op het moment van dit schrijven, hebben ongeveer 200 artikelen gepubliceerd beschrijven cel-MicroPOST interactie. Deze werken bespreken theoretische aspecten van MicroPOST afbuiging principes en praktische instructies voor de vervaardiging ervan. Het eerste artikel beschrijft de interactie van cellen en flexibele MicroPOST arrays werd gepubliceerd door Tan en collega's in 2003. ⁴ In tegenstelling tot de klassieke trekkracht microscopie (TFM), waar continue zachte substraten worden gebruikt voor het schatten nanonewton schaal cel contractiliteit, Tan et al. beschrijft een werkwijze met meerdere dicht bij elkaar gelegen verticale balken van silicone elastomeer. De belangrijkste voordelen van deze techniek blijken uit twee belangrijke functies. Eerst teneinde de cel-substraat schijnbare stijfheid veranderen men hoeft alleen de MicroPOST afmetingen te veranderen terwijlde substraatsamenstelling overigens gelijkblijvende en aldus verschillen in oppervlakte topologie en chemie vermijden. Tweede micropalen handelen als individuele veren die discreet kan worden geanalyseerd met geweld en ruimtelijke resoluties over de volgorde van de afzonderlijke focale adhesies en kan de analytische uitdagingen die inherent zijn aan een soortgelijk onderzoek door standaard TFM zijn verminderen.

Vandaag is de waaier van toepassingen voor MicroPOST arrays veel groter is dan alleen het in kaart brengen van de krachten voor een paar enkele cellen. Bijvoorbeeld, Akiyama meldt het gebruik van een geïsoleerde dorsale vaatweefsel uit mottenrupsband als een actuator voor een MicroPOST array teneinde een insect spier-powered autonome micro-robot ontwikkelen. ⁵

De meeste gepubliceerde aanvragen van micropalen gericht op studies van medische aandoeningen zoals infecties of kanker. Zo zijn MicroPOST arrays gebruikt om de kracht genereren van gebundelde type IV pili van Neisseria gonorrh bestuderenOEA kolonies die is gekoppeld aan signaalcascades verbeteren infectie. ⁶ Anderen hebben gebruikt om micropalen borstkankercellen behandeld met farmaceutische samenstellingen gericht op de cytoskelet bestuderen. ⁷

Afbuiging van een MicroPOST wordt vaak beschreven met behulp van klassieke bundel theorie voor een cantilever met een end load veronderstelling dat de cel hecht alleen het uiterste puntje van de MicroPOST. Hier is de uitgeoefende kracht F die een afbuiging δ veroorzaakt afhankelijk van de MicroPOST's "buigstijfheid" k en wordt berekend door:

(1)

met E, I en L zijn de Young's modulus, oppervlakte traagheidsmoment en straallengte resp. Echter, de resultaten van deze vergelijking geven slechts een algemene benadering van de krachten op het werk sinds balk snijden en buigen als substraat kromtrekken niet in ac worden genomentellen. Gezien het feit dat micropalen zijn meestal gemaakt van zachte materialen zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) -gebaseerde siliconenrubber deze factoren moeten worden opgenomen. . Schoen et al aangetoond dat er zo'n correctiefactor op basis van de verhouding van de MicroPOST (L / D) en de Poisson verhouding v de overeenkomstige polymeer ⁸ wordt gegeven door.:

(2)

Met T _tilt (v) een kantelbare coëfficiënt die fitting parameter a = 1,3 zoals kan worden gevonden in hetzelfde artikel omvat:

(3)

Dat betekent MicroPOST de gecorrigeerde stijfheid k _corr is het product van de zuivere buigstijfheid k = k _{buigen en} de correctiefactor corrgegeven door:

(4)

Daarom moet cel kracht berekeningen worden uitgevoerd met de meer verfijnde variatie van vergelijking (1) leest nu:

(5)

De impact van de correctie wordt meer duidelijk zodra typische waarden voor MicroPOST afmetingen worden gebruikt. Bijvoorbeeld, een 15-micron lang MicroPOST met een cirkelvormige dwarsdoorsnede en een diameter van 5 urn gemaakt van PDMS-gebaseerde siliconen rubber tot een correctiefactor van 0,77 en dus een gecorrigeerde berekening zou de uitgeoefende krachten cel overschatten met 23%. Dit wordt nog ernstiger voor micropalen met kleinere aspect ratio.

Traditioneel is MicroPOST beeldanalyse ook gebaseerd op geïdealiseerde balk buigen theorie. In 2005 heeft de groep die het gebruik van de MICR pionieropost arrays publiceerde een beeldanalyse-software geschikt voor MicroPOST analyse ⁹ De software vereist een softwarelicentie en de gebruiker moet drie beelden voor elke positie in te nemen.; één elk van de MicroPOST de boven- en onderkant vliegtuigen in de transmissie-modus en een andere in fluorescentie mode met de gekleurde cel. Na vergelijking van de bovenste en onderste posities voor elke MicroPOST bepaalt de software een kracht vectorveld en berekent daarmee samenhangende parameters als kracht per paal. Andere software pakketten bestaan ​​en hun analyse principes zijn kort in de desbetreffende artikelen die ze beschrijven genoemd, maar deze analytische software pakketten zijn over het algemeen niet voor iedereen beschikbaar. ^10,11

De MicroPOST matrices voor mapping cel krachten kunnen worden geclassificeerd als zijnde in een orthogonale MicroPOST layout of een hexagonaal is, waarvan de laatste het voordeel van gelijke afstand tussen alle spleten naaste micropalen. Typische micropalen have een cirkelvormige dwarsdoorsnede en de afmetingen variëren van 1,0 urn tot 10 urn in diameter en 2 tot 50 urn lengte. ⁴ echter micropalen met elliptische of vierkante doorsnede zijn ook gemeld. ^12,13

Het gebruik van PDMS-gebaseerde siliconen mengsels MicroPOST materiaal maakt voor het toevoegen van nanodeeltjes in het mengsel. Bijvoorbeeld het toevoegen van kobalt nano-staven maakt een magnetische activering van de MicroPOST en dus geeft een andere vrijheidsgraad om potentiële experimentele ontwerpen. ¹⁴ De meeste groepen produceren hun MicroPOST arrays op vlakke harde ondergronden zoals dekking van glas of in een petrischaal. Echter, Mann en collega meldde onlangs een MicroPOST matrix gevormd op een uitrekbaar membraan. ¹⁵ Dit maakt de toepassing van cel strekkrachten hechtende cellen tijdens de studie levende cellen subcellulaire dynamische responsen qua cel contractiliteit.

De alom gebruikte en meest Estabsteld werkwijze voor het maken MicroPOST arrays gebaseerd op zachte lithografie zoals beschreven in de protocollen van inzichtelijke Sniadecki en collega. ^16-18 Kortom standaard cleanroom processen worden toegepast om de microstructuren op een siliciumwafer gebruikt SU8 fotoresist genereren. Daarna volgt een kopieerproces waarbij de siliconenrubber gegoten via structuren overzetten in mallen. In een tweede stap deze schimmels worden gebruikt om de oorspronkelijke microstructuur behulp siliconenrubber op een gekozen substraat repliceren. Maar ondanks de grote en groeiende aantal publicaties in verband met de toepassing ervan, de oprichting van een productieproces voor micropalen neemt aanzienlijke hoeveelheid tijd, zelfs voor micro-technische deskundigen; er zijn veel processtappen die optimalisatie en aanpassing aan de specifieke testomgeving en MicroPOST lay-out nodig om een ​​acceptabel kwaliteitsniveau opleveren.

Commerciële MicroPOST arrays zijn nu beschikbaar in een kant-en-to-gebruik ("off-the-shelf") formaat met een constante hoge kwaliteit. Als zodanig zijn ze een alternatief voor de complexe en tijdrovende productieproces vereist ter plaatse produceren. In dit artikel werd een commercieel verkrijgbaar MicroPOST serie gebruikt voor het in kaart brengen cellulaire krachten afbeelding één helder-veld microscopie gebruikt. Nog belangrijker is dit artikel beschrijft en documenteert een volledig functionele open-source software genaamd MechProfiler, die beschikbaar zijn voor download als aanvullend materiaal om dit manuscript is. Een actief gehandhaafd versie van de software is ook te vinden op http://www.orthobiomech.ethz.ch.

De combinatie van een "off-the-shelf" test en een compatibele open-source analyse software aanzienlijk verlaagt de ingang hindernis om nauwkeurige TFM experimenten te bereiken. Onderzoekers zonder toegang tot ofwel clean room faciliteiten of de ontwikkeling van software ervaring met succes kan analyseren cellulaire krachten. Het stelt een gebruiker om zich te concentreren op het mechanosensitivity assay uitgang in plaats van de technologie zelf, en maakt trekkracht metingen beschikbaar om een ​​bredere gemeenschap. Bovendien is dit een belangrijke stap op de weg naar volledig automatische screening van MicroPOST arrays effenen.

De MechProfiler analyse software verwerkt afbeeldingen in bestandsformaat tiff, png, bmp en jpg. De beelden kunnen worden gemaakt met behulp van fluorescentie, fase contrast of fel-veld lichtmicroscopie. Het standalone programma loopt samen met de vrije Matlab Compiler Runtime (verkrijgbaar bij: Figuur 12) en de onderliggende algoritmes mogelijk maken gestroomlijnde beeldverwerking, waarmee de gebruiker om beelden met één of meerdere cellen te verwerken ongeveer 1 min. Verder kunnen deze cellen ofwel levend of "vast".

De MechProfiler software kan aanzienlijk verhogen gegevensanalyse throughput beroept op reproduceerbaarheid van de kwaliteit commerciële MicroPOST arrays, meer bepaald de standaard & #8220, niet afgebogen "-positie van elk record in de array kan worden aangenomen tegenover een ideale rooster (fabricageafwijkingen voor het raster in de arrays gebruikt voor deze studie minder dan 100 nm).

Kortom men opent een selectie van beeldbestanden voor analyse, gewassen ze naar de regio van belang, bepaalt de ambten waarop cellen of die moeten worden weggegooid, bepaalt de post posities, berekent de doorbuiging / krachten tegen de ideale raster, en ten slotte slaat alle cel-specifieke gegevens met de mogelijkheid voor de export, met inbegrip van een standaard kantoor spreadsheet.

Protocol

1. het kweken van cellen op MicroPOST Arrays Opmerking: Alle stappen moeten in een bioveiligheid kast worden uitgevoerd om de steriliteit te waarborgen. De hier gegeven volumes zijn voor T25 celcultuur flessen. Het celkweekmedium recept en cellen zaaidichtheid zijn geoptimaliseerd voor botkanker cellijnen HuO9 en M132. Bereid een celkweek voor het zaaien op een MicroPOST array. Inspecteer de celkweek kwaliteit door het plaatsen van de kolf op een standaard lichtmicroscoop…

Representative Results

Het belangrijkste voordeel van de beschreven techniek ligt in de eenvoud en de mogelijkheden voor snelle en effectieve integratie in routine laboratoriumwerk. De combinatie van commerciële sensor arrays van hoge kwaliteit gecombineerd met open-source software geeft informatie over mechanisch-gevoeligheid die anders toegang tot de cleanroom faciliteiten en diepgaande kennis van de beeldanalyse en de ontwikkeling van software zou nodig. Figuur 1 toont de workflow van de gepresenteerde methode. Het begint…

Discussion

Dit werk tracht het gebied van trekkracht microscopie vooraf door substantieel verlagen van technische en praktische belemmeringen voor de toegang. Deze belemmeringen van twee kanten komen. Eerst en vooral zijn de talloze niet-triviale technische uitdagingen die moeten worden overwonnen om reproduceerbaar vervaardigen en experimenteel Commissie MicroPOST array. Ten tweede, is het eveneens niet-triviale behoefte aan een betrouwbare semi-automatische analyse van cel krachten – rekening houdend dat een typisch experiment d…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera