Enkel og nøyaktig Mekano-profilering på Micropost Arrays

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Mekano-sensitive cellebasert analyse tillater undersøke heftende celler, med et bredt spekter av programmer som gjenspeiler den sentrale rollen som mekanikere kan spille i cellebiologi. Disse programmene ofte fokus på de underliggende mekanismene som driver subcellulære prosesser eller hel-celle atferd. På den ene side kan ytre miljøfaktorer som ekstra cellulær matrix sammensetning eller matrise stivhet dramatisk påvirke mekanisk og biologisk respons i en celle. ^1. Det samme kan observeres etter anvendelse av mange klasser av farmasøytisk aktive forbindelser, hvis effekter er kjennetegnes ofte ved hjelp av cellekulturmodeller. ^2. På den annen side genotypiske egenskaper, for eksempel de som forårsakes av spontane eller eksperimentelt indusert genetiske mutasjoner, kan indusere markerte endringer i celle-fenotype som er forbundet med endringer i cytoskjelettet struktur og funksjon. ^3. Disse eksemplene er bare noen få av de mange muligeemner som mekanisk fenotyping av celler er relevant, og alle disse har vært hensiktsmessig undersøkt med micropost arrays.

På skrivende stund, har ca 200 artikler er publisert beskriver celle-micropost interaksjon. Disse verkene diskutere teoretiske aspekter av micropost nedbøyning prinsipper samt praktiske instruksjoner om produksjonen. Den første artikkel som beskriver interaksjonen av celler og fleksible micropost matriser ble publisert av Tan og medarbeidere i 2003 ⁴ I motsetning til klassiske trekkraft mikroskopi (TFM) hvor kontinuerlige myke substrater benyttes for å estimere nanonewton-skala celle kontraktilitet, Tan et al. beskrives en fremgangsmåte ved hjelp av flere tett adskilte vertikale bjelker laget av silikon-elastomer. De viktigste fordelene med denne teknikken oppstår fra to viktige funksjoner. Først for å endre celle tilsynelatende underlaget stivhet man kun trenger å endre micropost dimensjoner samtidigsubstratblandingen ellers konstant, og således unngå forskjeller i overflate topologi og kjemi. Second microposts opptre som individuelle fjærer som kan diskret analysert med kraft og romlig oppløsning på rekkefølgen av enkelt fokale sammenvoksninger og kan redusere de analytiske utfordringer som er iboende til analog analyse av standard TFM.

I dag er utvalget av applikasjoner for micropost arrays stor grad overstiger bare kartlegging av krefter for noen enkeltceller. For eksempel rapporterer Akiyama bruk av en isolert ryggbeholder vev fra en møll larve som en aktivator for et micropost array, for å utvikle et insekt muskeldrevet autonome mikro-robot. ⁵

Imidlertid har de fleste publiserte anvendelser av microposts fokusert på studier av medisinske tilstander som infeksjon eller kreft. For eksempel har micropost arrays blitt brukt til å studere styrkegenerering av buntet type IV pili av Neisseria gonorrhOEA kolonier som er forbundet med signal kaskader styrke infeksjon. ⁶ Andre har brukt microposts å studere brystkreft celler behandlet med farmasøytiske forbindelser rettet cytoskjelettet. ⁷

Avbøyning av en micropost blir ofte beskrevet ved hjelp av klassisk teori stråle for en cantilever med en slutt belastning forutsatt cellen legger bare til helt i spissen av micropost. Her den påførte kraften F som fører til en bøyning δ avhenger av micropost er "bøyestivhet" k og beregnes ved:

(1)

med E, I og L er en Youngs modulus, område treghetsmoment og strålelengde hhv. Men resultatene fra denne ligningen bare gi en generell tilnærming av krefter på jobb siden strålen skjæring og bøying samt underlaget fordreining ikke er tatt i actelle. Tatt i betraktning at microposts er vanligvis laget av myke materialer som polydimethylsiloxane (PDMS) -baserte silikongummi disse faktorene må tas med. . Schoen et al viste at det er en slik en korreksjonsfaktor basert på størrelsesforholdet av micropost (L / D) og den tilsvarende polymer er Poisson ratio v ⁸ Det er gitt ved.:

(2)

Med t _vippe (v) er en koeffisient vippe som inneholder passende parameter a = 1,3 som kan bli funnet i den samme artikkel:

(3)

Det betyr at en micropost er korrigert stivhet k _corr er produktet av den rene bøyestivhet k = k _{bøye og} korreksjonsfaktoren korrgitt av:

(4)

Derfor bør celle styrkeberegninger utføres ved hjelp av mer raffinert variant av ligning (1) nå leser:

(5)

Virkningen av korreksjons blir mer åpenbar så snart som typiske verdier for micropost dimensjoner er brukt. For eksempel kan en 15-mikron lange micropost med et sirkulært tverrsnitt og en diameter på 5 um fremstilt av PDMS-baserte silikongummi fører til en korreksjonsfaktor på 0,77, og derfor en ikke-korrigert beregning ville overvurdere utøves cellekreftene med 23%. Dette blir enda mer alvorlig for microposts med mindre størrelsesforhold.

Tradisjonelt har micropost bildeanalyse også vært basert på idealiserte bjelke bøying teori. I 2005 gruppen som pioner i bruk av micropost arrays publisert en bildeanalyse programvare egnet for micropost analyse ⁹ Programvaren krever en programvarelisens, og brukeren må ta tre bilder for hver stilling.; ett hver fra micropost topp og bunn flyene i sendemodus og en annen i fluorescens modus med farget celle. Etter sammen de øvre og nedre stillinger for hver micropost programvaren bestemmer en kraftvektor-feltet, og beregner relaterte parametere som kraft pr stolpe. Andre programvarepakker finnes og deres analytiske prinsipper er kort nevnt i de tilsvarende artikler som beskriver dem, men disse analytiske programvarepakker er generelt ikke er offentlig tilgjengelig. ^10,11

De micropost matriser beregnet for kartlegging cellekrefter kan bli klassifisert som enten å være i en ortogonal micropost layout eller en sekskantet en, den sistnevnte har fordelen av ekvidistante gapene mellom alle nabo microposts. Typiske microposts hahar et sirkulært tverrsnitt, og deres dimensjoner i området fra 1,0 um til 10 um i diameter og 2 til 50 pm i lengde. ⁴ er imidlertid microposts med elliptisk eller kvadratisk tverrsnitt, er også rapportert. ^12,13

Bruken av PDMS-baserte silikonblandinger som micropost materiale gir mulighet for å legge til nanopartikler i blandingen. For eksempel legge kobolt nanostaver gjør en magnetisk aktivering av micropost og dermed gir en annen grad av frihet til potensielle eksperimentelle design. ¹⁴ De fleste grupper produsere sine micropost arrays på flate stive underlag som cover glass eller inne i en petriskål. Men Mann og medarbeidere har nylig rapportert en micropost matrise dannet på en elastisk membran. ¹⁵ Dette tillater bruk av celle strekker styrker til adherente celler mens du studerer levende celle subcellulær dynamisk respons i form av celle kontraktilitet.

Den mye brukt og mest estabblert fremgangsmåte for fremstilling av micropost matriser er basert på myklitografi som beskrevet i de innsikts protokoller Sniadecki og kolleger. ^16-18 I korte standard renrom prosesser blir brukt til å generere mikrostrukturene på toppen av en silisiumskive ved hjelp av SU8 fotoresist. Dette etterfølges av en kopieringsprosess, karakterisert ved at silikongummien er støpt over strukturene overføre dem i formene. I et annet trinn i disse formene blir brukt til å gjenskape den opprinnelige mikrostrukturen ved hjelp av silikongummi på toppen av et valgt substrat. Men til tross for den store og økende antall publikasjoner knyttet til deres søknad, etablere en produksjonsprosess for microposts tar mye tid selv for micro-engineering eksperter; Det er mange prosesstrinn som krever optimalisering og tilpasning til den spesifikke laboratoriemiljø og micropost oppsett for å gi et akseptabelt kvalitetsnivå.

Kommersielle micropost arrays er nå tilgjengelig i en ready-tformat o-bruk ("off-the-sokkel") med en gjennomgående høy kvalitet. Slik de er et alternativ til det komplekse og lange produksjonsprosessen som kreves for produksjon på stedet. I dette papiret et kommersielt tilgjengelig micropost rekke ble brukt for å kartlegge celle krefter ved hjelp av en enkelt lys-felt mikroskopi bilde. Enda viktigere denne artikkelen beskriver og dokumenterer en fullt funksjonell åpen kildekode programvare kalt MechProfiler, som er tilgjengelig for nedlasting som supplerende materiale til dette manuskriptet. Et aktivt opprettholdt versjon av programvaren kan også bli funnet på http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Kombinasjonen av en "off-the-sokkel" analysen og en kompatibel open-source analyse programvare markert senker inngangs hinder for å oppnå nøyaktige TFM eksperimenter. Forskere uten tilgang til enten rene romfasiliteter eller programvare utviklingskompetanse kan analysere cellulære krefter vellykket. Det gjør det mulig for en bruker å fokusere på mechanosensitivity analysen utgang snarere enn teknologien i seg selv, og gjør trekkraft målinger tilgjengelig for et bredere fellesskap. Videre er dette et viktig skritt for å bane vei mot helautomatiske screening av micropost arrays.

Den MechProfiler analyse programvare behandler bilder i filformatet TIFF, PNG, BMP og jpg. Bildene kan tas med fluoresens, fase kontrast eller lyse-feltet lysmikroskopi. Den frittstående program kjøres sammen med den frie Matlab Compiler Runtime (tilgjengelig på: Figur 12) og underliggende algoritmer tillate for strømlinjeformet bildebehandling, som gjør det mulig å behandle bilder med én eller flere celler i ca 1 min. Videre kan disse cellene enten levende eller "fast".

Den MechProfiler programvaren er i stand til å øke gjennomstrømningen av data-analyse ved å stole på reproduserbarheten av kommersiell kvalitet micropost matriser, mer spesifikt, standard & #8220, som ikke er forandret retning "posisjonen til hvert innlegg i matrisen kan antas mot en ideell grid (produksjonsavvik for rutenettet i arrays brukes for denne studien var mindre enn 100 nm).

Kort sagt en åpner et utvalg av bildefiler for analyse, beskjærer dem til regionen av interesse, definerer de innleggene som omfattes av celler eller som må kastes, bestemmer legg posisjoner, beregner nedbøyninger / krefter mot den ideelle rutenett, og til slutt lagrer alle cellespesifikke data med en mulighet for eksport, blant annet til en standard office regneark.

Protocol

1. Dyrknings Cells om Micropost Arrays Merk: Alle trinn må utføres i en biosikkerhet skap for å sikre sterilitet. De oppgitte volumer er for T25 cellekulturflasker. Cellekulturmediet oppskrift og celletettheten poding er optimalisert for ben kreftcellelinjer HuO9 og M132. Forberede en cellekultur for seeding på en micropost array. Inspisere kvaliteten cellekulturen ved å plassere kulturflaske på et standard lysmikroskop. Sørg for at cellene viser en typisk vekst og…

Representative Results

Den største fordelen med den beskrevne teknikk ligger i dens enkelhet og potensialet for rask og effektiv integrering i rutinelaboratoriearbeid. Kombinasjonen av høy kvalitet kommersielle sensor arrays forbundet med åpen kildekode gir informasjon om mekanisk-følsomhet som ellers ville krever tilgang til renrom fasiliteter og inngående kjennskap til bildeanalyse og programvareutvikling. Figur 1 viser arbeidsflyten i fremlagt metoden. Det starter med å utarbeide og såing celler på micropost array….

Discussion

Dette arbeidet søker å fremme innen trekkraft mikroskopi av vesentlig senke tekniske og praktiske etableringshindringer. Disse barrierene kommer fra to sider. Først og fremst er de mange ikke-trivielle tekniske utfordringer som må overvinnes for å reproduserbart produsere og eksperimentelt provisjon en micropost array. For det andre, er den tilsvarende ikke-triviell behov for en pålitelig semi-automatisk analyse av enkeltcelle krefter – med tanke på at et typisk forsøk kreve at analysen av hundrevis eller kanskj…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera