Enkelt och exakt Mechano-profilering på Micropost Arrays

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Mekano känsliga cellbaserade analyser tillåter för att undersöka vidhäftande celler, med ett brett spektrum av tillämpningar som återspeglar den centrala roll som mekaniker kan spela i cellbiologi. Dessa program fokuserar ofta på de bakomliggande mekanismer som driver subcellulära processer eller hela-cellens beteende. Å ena sidan, kan yttre miljöfaktorer såsom extracellulär matriskomposition eller matrisstelhet dramatiskt påverka den mekaniska och biologiska responsen av en cell. ¹ Detsamma kan observeras efter användning av många klasser av farmaceutiskt aktiva föreningar, vars effekter är kännetecknas ofta med hjälp av cellodlingsmodeller. ² Å andra sidan genotypiska egenskaper, såsom de som orsakas av spontana eller experimentellt inducerad genetiska mutationer, kan inducera markerade förändringar i cellfenotyp som är associerade med förändringar i cytoskelettet struktur och funktion. ³ Dessa exempel är bara några av de många möjligaämnen för vilka mekanisk fenotypning av celler är relevant, och alla dessa har fördel undersökts med micropost matriser.

Vid tidpunkten för denna skrift, har cirka 200 artiklar publicerats som beskriver cell micropost interaktion. Dessa arbeten diskutera teoretiska aspekter av micropost böjnings principer samt praktiska anvisningar om deras tillverkning. Den första artikeln beskriver samspelet mellan celler och flexibla micropost matriser publicerades av Tan och kollegor under 2003. ⁴ I motsats till klassisk dragkraft mikroskopi (TFM) där kontinuerliga mjuka underlag används för att uppskatta nanonewton skala cellkontraktilitet, Tan et al. beskrivit ett förfarande med hjälp av flera tätt åtskilda vertikala balkar av silikonelastomer. De främsta fördelarna med denna teknik dyker upp från två viktiga funktioner. Först för att ändra cell uppenbara substrat styvhet behöver man bara ändra micropost dimensioner samtidigtsubstratkompositionen annars konstant och därmed undvika skillnader i ytan topologi och kemi. Andra microposts agera som enskilda fjädrar som kan diskret analyseras med kraft och rumsliga resolutioner om i storleksordningen enskilda fokala sammanväxningar och kan minska de analytiska utmaningar som är förbundna med liknande analys av standard TFM.

Idag utbudet av applikationer för micropost arrayer vida överstiger bara kartläggning av krafterna för några enstaka celler. Exempelvis Akiyama rapporterar användningen av en isolerad dorsala kärl vävnad från en mal caterpillar som ett manövreringsorgan för en micropost matris, i syfte att utveckla en insekt muskeldriven autonom mikro roboten. ⁵

Emellertid har de flesta publicerade tillämpningar av microposts fokuserat på studier av medicinska tillstånd som infektion eller cancer. Exempelvis har micropost arrayer använts för att studera kraftgenereringen av medföljande typ IV pili av Neisseria gonorrhOEA kolonier som är associerad med signalkaskader öka infektion. ⁶ Andra har använt microposts att studera celler bröstcancer som behandlats med läkemedelssubstanser som riktar cytoskelettet. ⁷

Avböjning av en micropost beskrivs ofta med användning av klassisk balkteori för en konsol med en ändbelastning med antagande cellen fäster endast till den yttersta spetsen av den micropost. Här den anbringade kraften F som orsakar en nedböjning δ beror på micropost s "böjstyvhet" k och beräknas genom:

(1)

med E, I och L är Youngs modul, område tröghetsmoment och bomlängd respektive. Men resultaten från denna ekvation ger endast en allmän uppskattning av de krafter i arbetet, eftersom strålen klippning och bockning samt substrat skevhet inte tas i acräkna. Med tanke på att microposts är oftast gjorda av mjuka material som polydimetylsiloxan (PDMS) -baserade silikongummi dessa faktorer måste tas med. . Schoen m.fl. visade att det finns en sådan korrektionsfaktor baserad på bildformat för micropost (L / D) och motsvarande polymerens Poisson förhållande v ⁸ Det ges av.:

(2)

Med T _tilt (v) är en tiltkoefficient som innehåller passande parameter a = 1.3 som kan hittas i samma artikel:

(3)

Det innebär en micropost rättade styvhet k _corr är produkten av den rena böj styvhet k = k _{böj och} korrektionsfaktorn corrgetts av:

(4)

Därför bör cellkraftberäkningar utföras med mer förfinad variant av ekvation (1) nu läser:

(5)

Effekterna av korrigeringen blir mer uppenbara så snart som typiska värden för micropost dimensioner används. Till exempel, en 15-micron långa micropost med ett cirkulärt tvärsnitt och en diameter av 5 pm gjord av PDMS-baserade silikongummi leder till en korrektionsfaktor på 0,77 och därmed ett okorrigerat beräkning skulle överskatta utövade cellkrafterna med 23%. Detta blir ännu allvarligare för microposts med mindre bildformat.

Traditionellt har micropost bildanalys även baserats på idealiserade balkböjning teori. År 2005 den grupp som börjat använda sig av MICRopost arrayer publicerade en bildanalysprogram lämpad för micropost analys ⁹ Programmet kräver en programvarulicens och användaren måste ta tre bilder för varje position. en vardera från micropost s topp- och bottenplan i sändningsläge och en annan i fluorescensläge med den färgade cellen. Efter att ha jämfört de övre och nedre positionerna för varje micropost mjukvaran bestämmer en kraftvektorfält och beräknar relaterade parametrar såsom kraft per tjänst. Andra mjukvarupaket finns och deras analys principer kortfattat nämns i motsvarande artiklar som beskriver dem, men dessa analytiska programvarupaket är i allmänhet inte tillgängliga för allmänheten. ^10,11

De micropost matriser avsedda för kartläggning cell krafter kan klassificeras som antingen är i ett ortogonalt micropost layout eller en hexagonal en, den senare som har fördelen av ekvidistanta mellanrum mellan alla grann microposts. Typiska microposts hektarve ett cirkulärt tvärsnitt och deras dimensioner varierar från 1,0 | im till 10 | j, m i diameter och två till 50 ^ m i längd. ⁴ emellertid microposts med elliptiskt eller kvadratiskt tvärsnitt har också rapporterats. ^12,13

Användningen av PDMS-baserade silikonblandningar som micropost material medger att lägga till nanopartiklar i blandningen. Till exempel att lägga till kobolt nanostavar möjliggör en magnetisk aktivering av micropost och därmed ger ett annat frihetsgrad till potentiella experimentell design. ¹⁴ De flesta grupper producera sina micropost arrayer på plana styva substrat såsom skyddsglas eller inuti en petriskål. Men Mann och medarbetare rapporterade nyligen en micropost array bildas på ett töjbart membran. ¹⁵ Detta gör att tillämpningen av cellsträckkrafter till vidhäftande celler medan de studerar levande celler subcellulär dynamiska svar när det gäller cellkontraktilitet.

Den allmänt använda och mest om inrättandeinrättats förfarande för framställning micropost matriser är baserad på mjuk litografi, såsom beskrivs i de insikts protokollen för Sniadecki och kollegor. ^16-18 I korta standardrenrumsprocesser används för att generera mikrostrukturerna på toppen av en kiselskiva med användning SU8 fotoresist. Detta följs av en kopieringsprocess, vari silikongummit gjuts över de strukturer överföra dem i formar. I ett andra steg är dessa formar användes för att replikera den initiala mikrostruktur med användning av silikongummi på toppen av ett valt substrat. Men trots det stora och växande antal publikationer relaterade till deras ansökan om upprättande av ett tillverkningsprocess för microposts tar avsevärd tid även för mikrotekniska experter, det finns många processteg som kräver optimering och anpassning till den specifika labbmiljö och micropost layout för att ge en acceptabel kvalitetsnivå.

Kommersiella micropost arrayer finns nu i en färdig-to-användning ("off-the-shelf") format med en genomgående hög kvalitet. Som sådana är de ett alternativ till de komplexa och tidskrävande tillverkningsprocess som krävs för tillverkning på plats. I denna uppsats en kommersiellt tillgänglig micropost array användes för att kartlägga cellulära krafter med hjälp av en enda ljusa fält mikroskopi bild. Ännu viktigare här artikeln beskriver och dokumenterar en fullt fungerande öppen källkod som heter MechProfiler, som är tillgänglig för nedladdning som kompletterande material till detta manuskript. En aktivt underhållna version av programvaran kan också hittas på http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Kombinationen av en "off-the-shelf" analys och en kompatibel öppen källkod analysprogram sänker markant posten hindret för att uppnå korrekta TFM experiment. Forskare utan tillgång till vare sig renrumsfaciliteter eller mjukvaruutveckling expertis kan analysera cellulära krafter framgångsrikt. Det gör det möjligt för en användare att inrikta sig på de mechanosensitivity analys utgång snarare än tekniken i sig, och gör dragkraft mätningar tillgängliga för en bredare gemenskap. Dessutom är detta ett viktigt steg för att bana väg för helautomatisk screening av micropost matriser.

Den MechProfiler analysprogram behandlar bilder i filformatet tiff, png, bmp och jpg. Bilderna kan tas med användning av fluorescens, faskontrast eller ljusfält Ijusmikroskopi. Den fristående program körs tillsammans med den fria Matlab Compiler Runtime (tillgänglig på: Figur 12) och underliggande algoritmer möjliggör strömlinjeformad bildbehandling, vilket gör det möjligt för användaren att bearbeta bilder med enkla eller multipla celler i ca 1 min. Vidare kan dessa celler antingen levande eller "fasta".

Den MechProfiler programvara kan kraftigt öka dataanalys genomströmningen genom att förlita sig på reproducerbarhet kvalitet kommersiella micropost arrayer, närmare bestämt standard & #8220, icke-böjs "position varje inlägg i gruppen kan antas mot en idealisk galler (avvikelser för nätet i grupperna som används i denna studie var mindre än 100 nm).

Kort sagt en öppnar ett urval av bildfiler för analys, beskär dem till regionen av intresse, definierar de tjänster som omfattas av celler eller som måste kasseras, bestämmer postpositioner, beräknar deflektioner / krafter mot den ideala nätet, och slutligen sparar alla cellspecifika data med möjlighet till export, bland annat till en vanlig kontors kalkylblad.

Protocol

1. odling av celler på Micropost Arrays Obs: Alla steg måste utföras i en biosäkerhet skåp för att säkerställa sterilitet. De volymer som anges här är för T25 cellodlingsflaskor. Cellodlingsmediet recept och cellsåddtäthet är optimerade för ben cancercellinjer HuO9 och M132. Förbered en cellkultur för sådd på en micropost array. Inspektera cellodlingskvalitet genom att placera odlingskolven på en standardljusmikroskop. Se till att cellerna visar en typ…

Representative Results

Den största fördelen med den beskrivna tekniken ligger i dess enkelhet och potential för snabb och effektiv integrering i den rutinmässiga laborationer. Kombinationen av högkvalitativa kommersiella sensorsystem parat med öppen källkod ger information om mekano-känslighet som annars skulle kräver tillgång till renrumsfaciliteter och fördjupad kunskap om bildanalys och mjukvaruutveckling. Figur 1 visar arbetsflödet för den presenterade metoden. Det börjar med att förbereda och sådd celler …

Discussion

Detta arbete syftar till att främja det gäller dragkraft mikroskopi genom att väsentligt sänka tekniska och praktiska hinder för inträde. Dessa hinder kommer från två sidor. Först och främst är de många icke-triviala tekniska utmaningar som måste övervinnas för att reproducerbart tillverka och experimentellt beställa en micropost array. För det andra, är det likaledes icke-triviala behov av en tillförlitlig halvautomatisk analys av encelliga krafter – med tanke på att ett typiskt experiment kan kräv…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera