Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من
Summary
Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.
Abstract
Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.
Introduction
تعتمد دراسة مسببات الأمراض على أنظمة نموذج كافية لمحاكاة العدوى في الجسم الحي. وبالنسبة لبعض العوامل المعدية، ونظم نموذج كافية وتفتقر بينما بعض الأنظمة المستخدمة هي بعيدة كل البعد عن المثالية. ومن الأمثلة على ذلك بكتيريا المعدة هيليكوباكتر بيلوري (H. بيلوري)، والذي يرتبط سببيا لتطوير سرطان المعدة. ولكن في غياب نظام زراعة الخلايا أكثر ملاءمة، العديد من الدراسات التي تهدف إلى تحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مرض السرطان السرطان استخدام خطوط الخلايا، التي تمثل نقطة النهاية لسلسلة السرطانية. أن الخلايا الأولية، غير حولت يكون نموذجا أفضل لهذه الدراسات. ومع ذلك، هي الخلايا الأولية متوفرة فقط من عدد قليل من المانحين ولا يمكن أن تكون مثقف لفترات أطول من الوقت. في السنوات الأخيرة، جعلت أبحاث الخلايا الجذعية تقدما كبيرا لتوفير مصادر جديدة للثقافات الخلية الأولية لدراسة البيولوجيا العدوى.
ثقافات منوقد استخدمت ثلاثة مصادر الخلايا الجذعية: الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)، والخلايا التي يسببها المحفزة الجذعية (التوجيهية) أو الخلايا الجذعية البالغة. تم استخدامها في تصميم نموذج العدوى بفيروسات، مثل الفيروس المضخم للخلايا 1،2 أو الالتهاب الكبدي الفيروسي ج 3-7، والطفيليات، مثل المنجلية 8 أو 9 التوكسوبلازما، والبكتيريا، مثل باكتيريويدز thetaiotaomicron 10 أو السالمونيلا الملهبة لل11. وفي الآونة الأخيرة، تم نشر العديد من المناهج لنموذج عدوى H. بيلوري مع organoids المستمدة من ESC أو الجذع خلايا 12، الخلايا الجذعية الماوس الكبار 21،22 أو الإنسان الخلايا الجذعية البالغة 13-15.
تطوير الثقافات عضي من الخلايا الجذعية البالغة نشأت من الدراسة، والتي كانت المصنفة الخلايا الجذعية واحدة معزولة عن ظهارة الأمعاء الفئران في مصفوفة 3 الأبعاد وجزءا لا يتجزأ من المتوسطة التي تحاكي البيئة من الخلايا الجذعية المعوية تحتوي EGF كما mitogen، R-spondin لتعزيز إشارات Wnt ورأس لمنع البروتين morphogenic العظام (BMP) مما يشير إلى 16. ولا سيما هذه الثقافات لا تتطلب ثقافة مشتركة مع خلايا اللحمة المتوسطة. في هذه الظروف، فإن الخلايا الجذعية تتكاثر وتشكل هياكل صغيرة مع المجالات التي تؤوي خلايا الخبايا المعوية، والمجالات التي تحتوي على خلايا زغابة المعوية. وبالتالي فإن organoids تنظيم الذاتي لتقليد الوضع في الجسم الحي. اليوم، والخلايا الجذعية البالغة من العديد من الفئران والأنسجة إنسانية يمكن زراعتها في المختبر وتقرير المصير، تنتظم organoids التي تشبه في الجسم الحي نظيرهما، مثل الأمعاء الدقيقة والقولون 17، 13،18 المعدة والكبد 19،20، 21 و البنكرياس البروستاتا 22.
نحن هنا نقدم بروتوكول الفيديو إلى الماوس الثقافة أو organoids المعدة البشري من سل الجذعية للبالغينليرة سورية وmicroinject لهم H. بيلوري. ويستند هذا البروتوكول على تقارير سابقة 13،18. هذه الطريقة يمكن تكييفها للزراعة واصابة الثقافات عضي أخرى مثل organoids الأمعاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.
Materials
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/mL, final concentration 200 ng/mL |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/mL), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-Free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Outro | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Cappillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
Referências
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett’s Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -. K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a ‘Living Organoid Biobank’ of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
