使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em>シロイヌナズナシュードモナスシリン</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
専門のモバイル免疫細胞の非存在下では、植物は、病原体の攻撃から身を守るために彼らのローカライズされたプログラム細胞死と全身獲得抵抗性を利用します。プラント全体の免疫応答に特有のシロイヌナズナ遺伝子の寄与は、特異的かつ定量的に感染した組織内の病原体の成長を測定することによって評価することができます。 30年以上にわたり、hemibiotrophic細菌シュードモナスシリンPV。maculicola ES4326（PSMの ES4326）が広くシロイヌナズナ免疫応答の根底にある分子メカニズムを研究するためのモデル病原体として適用されています。葉組織への病原体を提供するために、複数の接種方法が確立されている、 例えば、シリンジ浸潤、ディップ接種、スプレー、真空浸透、および洪水接種。以下のプロトコルは、大人の葉に毒性の強いPSM ES4326を提供するために最適化された注射器浸潤法を説明土壌栽培シロイヌナズナ植物と正確には、この病原体に向けて強化された疾患感受性（EDS）をスクリーニング。また、このプロトコルは、さらに、サリチル酸（SA）-Triggeredイミュニティ（STI）とMAMP・トリガ免疫（MTI）を含む植物防御の異なる層内に特異的な免疫欠陥を分析するために、複数の前処理で補充することができます。
Introduction
それらの固着性のために、植物は、常に様々なライフスタイルや栄養戦略1を示す病原体の過多によって脅かされています。壊死栄養性病原体積極的に秘密の毒素や酵素が宿主組織を殺すために、死んだ細胞1に供給するようにしながら、最初の近似として、生物栄養性病原体は、栄養素を取得する生きている彼らのホストを維持します。病原体と呼ばれるhemibiotrophsの別のグループは、病原体の蓄積2の特定のしきい値に達した時に壊死栄養段階への生物栄養段階とシフトとの感染のコースを開始します。効果的にこれらの微生物に対して自身を守るために、植物は、病原体の攻撃を検出してトリガするために、複数の監視機構を搭載した複雑な先天性免疫系を進化させてきた細胞死3だけでなく、全身獲得抵抗性（SAR）を4プログラム局在しました。現在の研究は不可欠SIGを特徴付けるに焦点を当てていますnalingコンポーネントと植物免疫系5内のクロストーク。
「ジグザグ」モデル5で提案されているように、植物の先天性免疫応答の最初の層は、微生物の侵入を検出するために、原形質膜局在パターン認識受容体（のPRR）の存在を必要とします。 PRRは、微生物関連分子パターン（ミリアンペア）を認識し、MAMP・トリガ免疫（MTI）6を確立することができます。抗菌PRタンパク7をコードする遺伝子の転写のアップレギュレーションを誘導するだけでなく、MTIは、細胞壁の活性酸素種の産生（ROS）および活性窒素種（RNS）、カロースの堆積を含む病原体の増殖を、停止イベントの様々なつながり同様に、複数のキナーゼシグナル伝達の活性化は、8が経路として。
これまで、いくつかのミリアンペア、細菌flg22 9を含む 、シロイヌナズナでMTIをトリガするために同定されています</sup>（フラジェリンに由来する22アミノ酸断片）、および構造細胞壁成分elf18 10（細菌の翻訳伸長因子Tuから18アミノ酸）11ペプチドグリカン。成功した感染を確立するには、いくつかの特殊な病原体は、細胞内または細胞間空間に秘密の病原性エフェクタータンパク質の能力を進化させ、その結果、MTIを抑制し、エフェクター・トリガ感受性（ETS）12,13をトリガしています。例えば、病原性エフェクターは感染組織14-16内の疾患の発症を誘導するためにMTIのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）のリン酸化カスケードを不活性化することができます。ホストと病原体との間の動的共進化の間に、植物もエフェクタータンパク質を認識し、病原体の病原性分子17を減衰させるために反撃の戦略を開発しました。この直接的または間接的エフェクターの認識は、病害抵抗性（R）タンパク質18によって媒介されます。トンの大部分裾はNB-LRRのメンバー（ヌクレオチドが結合およびロイシンリッチリピート）ファミリー19です。 Rタンパク質によって非病原性エフェクターの認識は、エフェクタートリガ免疫（ETI）20として特徴付け強く、より広範な免疫応答を誘発します。防御遺伝子21の発現および防衛代謝物22の産生を誘導するほかに、ETIは、多くの場合、隣接する組織3に広がるの病原体を制限するために過敏反応（HR）として知られている急速なローカライズされたプログラムされた細胞死につながります。
プログラムされたローカライズされた細胞死23に加えて、植物は（SAR）4全身獲得抵抗性と呼ばれる長期的かつシステム全体の免疫応答を開始することができます。生物栄養性病原体でのチャレンジの際に、植物細胞は、局所および全身の組織24の双方において、内因性の植物ホルモンのサリチル酸（SA）とPRタンパク質の生合成および蓄積を誘発します。トンを通して彼のプロセスは、準備の高まり状態は、病原体24の広いスペクトルによってその後の感染の間に速い防御応答を取り付けるため可能に感染していない葉で達成されます。 SAおよびそのようなベンゾなどの合成類似体（1,2,3） -チアジアゾール-7-カルボチオ酸 S -メチルエステル（BTH）および2,6-ジクロロ酢酸（INA）、化学的にサリチル酸を誘導することができる（SA）外部アプリケーション24時-Triggeredイミュニティ（STI）。病原性関連遺伝子1（NPR1）のNonexpressorは、局所および全身の組織21,25,26の両方でSA媒介防御応答時の主要な転写調節因子としてのSA受容体および機能の一つであることが提案されています。それは決定的にNPR1は、SARの確立のために必要とされ、NPR1の損失はシュードモナスシリン 25の方に劇的な感受性につながることが実証されています。
広く植物の分子の寄与を特徴づけるために、植物病原体相互作用のコンポーネントは、複数のバイオアッセイは、ROSは27バーストを含め、具体的な防衛のイベントを測定するために、それらのタンパク質生成物21のカロース沈着28、防御遺伝子の発現および蓄積を開発されてきました。これらの個々のアッセイは、植物免疫応答の特定のフォームへの洞察を提供することができるが、それらのどれも、しかし、植物全体レベルでの完全な防御応答を表現することができません。逆に、感染後の病原体の成長の定量化は、生物レベルでの免疫応答の全体的な推定値を提供します。したがって、正確性の高い標準化された病原体接種アッセイの開発と最適化は、シロイヌナズナの免疫応答の研究と発見を燃料することが重要です。
シュードモナスシリン 、グラム陰性細菌は、Arabidops含む植物宿主の範囲の疾患を引き起こすことができる植物病原体として同定されました29です。 P. -モデル植物病原体システム、シロイヌナズナとして、 syringaeの相互作用は、広く植物の防御応答に29の基礎となる分子メカニズムを理解するために適用されています。今までは、P。50を超えますシリンゲの pathovarsは、異なる植物種30に感染する能力に基づいて同定されました 。P. syringaeの PV。 トマトDC3000（PST DC3000）31 と P. syringaeのPV。maculicola ES4326（PSM ES4326）32は、二つの最も広く使用され、広範囲に特徴付け病原性株です。別に植物によって認識され、MTI応答を誘発されることから、pstファイル DC3000とPSM ES4326は、MTIを抑制し、病原体の成長31,33を支持するETSをトリガするために病原性エフェクタータンパク質を分泌することができます。
機能的にシロイヌナズナとPとの間の相互作用を分析するために、複数のシリン、0;病原体感染の方法は、病原体の送達アプローチに基づいて開発されてきました。土壌生育した植物は、病原体は、シリンジ浸潤、真空浸透、浸漬、噴霧接種接種29,34によって送達することができます。最近、苗洪水接種アッセイは、組織培養での大規模なスクリーニングを行うために開発された若いアラビドプシス植物35の成長プレート。シリンジ浸潤は、最も一般的に使用される手法の一つとして、手動で気孔29と呼ばれる自然の葉の開口部を通してアポプラストに病原体を提供しています。 Pのこのアプローチにより、等量syringaeのは、感染した葉に浸潤することができ、植物の免疫応答の強度が反比例病原菌の成長レベルと相関しています。したがって、病原体の成長の定量化は、植物全体レベルでの免疫機能を評価するための最適なアプローチとして機能します。また、シリンジ浸潤がbのできる局所および全身の組織を、区別することができますSAR 36の根底にある分子機構の特性を明らかにするのに適切な電子。
以下のプロトコルでは、強化された疾患感受性（EDS）のためのシロイヌナズナ変異体をスクリーニングするために、PSM ES4326と最適化された注射器浸潤アッセイを説明します。このプロトコルは、2つのシロイヌナズナの遺伝子型を採用する：野生型生態型コロンビア-0（COL-0）植物（コントロール）とnpr1-1の機能喪失型変異体を （hypersusceptible） それは、病原性細菌株PSM ES4326 37で感染します。 npr1-1変異体は、チロシンに高度に保存されたヒスチジンを変更し、25の非機能性タンパク質をレンダリングNPR1分子のアンキリンリピートのコンセンサス配列内の点変異を保有します。また、シリンジ浸潤アッセイの改変の数は、MTIおよびSTIを含む免疫応答の特定の層の欠陥の定量化を可能にすることが記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
利用可能な農地が減少し、人口が増加すると、世界中の研究者が作物改良のためのニーズを押すでチャレンジされています。収率が大幅に様々な生物的および非生物的ストレスによって影響を受ける可能性があります。その中でも、病原体感染だけでは45米国では約12％の損失を担当する作物収量の減少の主な原因の一つです。この問題を解決するには、大規模な研究は、モデルのシ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
Referências
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