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Neurociência

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1 つの蛍光信号が使用されている場合に適用されます。

Abstract

このプロトコルの目的は、表皮内神経線維内のミトコンドリアを勉強することです。したがって、神経固有のミトコンドリアを分離し、感覚神経の遠位先端のミトコンドリアの病気による変化を評価する 3 D 画像処理・解析技術が開発されました。プロトコルは、蛍光免疫組織化学、共焦点顕微鏡と神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して 3 D 画像解析手法を組み合わせたものです。詳細なパラメーターは、神経固有のミトコンドリアを分離するこれらのテクニックを使用する方法の具体的な例を提供するために手順の中で定義されます。抗体を用いて神経をラベルし、皮膚の組織切片内ミトコンドリア信号パンチ生検、それぞれ緑、赤の蛍光シグナルとミトコンドリア神経を視覚化する間接蛍光抗体法が続いています。Z シリーズ画像を共焦点顕微鏡で取得した、3 D 解析ソフトウェアが処理し、信号を分析する使用されました。記述されている正確なパラメーターに準拠する必要はありませんが、染色、集録・解析手順全体の選択のものと一致することが重要です。このプロトコルの強さださまざまな状況に適用されるそれ以外の場合、一人で勉強することが可能となるだろう他の信号を分離する 1 つの蛍光信号が使用されています。

Introduction

ミトコンドリアは、バッファリング、カルシウムと規制壊死とアポトーシス細胞死1,2,3セルのエネルギーを生産を含む重要な細胞機能を提供します。中枢神経系は、ミトコンドリア呼吸を介してニューロンがアデノシン三リン酸 (ATP) の形で高度の細胞のエネルギーを生成することを示唆している体4と比較して高い代謝率は。多くの神経機能が ATP5、特にシナプス6に依存していること証拠書類。したがって、神経細胞内のミトコンドリアの分布は重要です。

最後の 10 年間で多くの情報が示している人身売買および神経細胞のミトコンドリアのドッキングは非常に調整されます。モーター蛋白質ニューロンを通して特定の細胞コンパートメントにミトコンドリアの配布に関与しています。ミトコンドリアの人身売買は、ニューロンの軸索と樹状突起、相馬から遠く離れたプロジェクトのために特に重要です。キネシン モーター蛋白質は主に (相馬) から前向性ダイニン モーター蛋白質直接 (相馬) に向かって逆行運動7,8,9ながら微小管に沿ってミトコンドリアの人身売買を直接します。,10です。 このようなミトコンドリア膜電位とインパルス伝導存在とミトコンドリア人身売買11,12,13の方向に影響を与える携帯電話の信号があります。

ミトコンドリアを輸送に加えて Ranvier のノードやシナプス8,14,などの高エネルギー要求がある特定の細胞コンパートメントにミトコンドリアをローカライズするのには特殊な蛋白質があります。17します。 実際には、軸索内のミトコンドリアの大半が非運動性9,13,18。アクチン細胞骨格19–21に他の蛋白質アンカーのミトコンドリア中の軸索に沿って微小管の syntaphilin アンカー ミトコンドリアのような専門にされた蛋白質。成長因子およびカルシウムなどのイオンは、ミトコンドリアが必要な21,22,23の地域にローカライズするため運動の停止をサポートする報告されています。

一緒に取られて、人身売買とミトコンドリアのドッキングがニューロンの適切な機能のために不可欠です。、これを支持するミトコンドリア輸送の混乱が関連付けられているアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、ハンチントン病、遺伝性痙性を含むいくつかの神経学的な条件対麻痺、視神経萎縮15,24,25,26,27.最近の研究が糖尿病神経障害、糖尿病28,29,30,31 に関連付けられている感覚の損失のための潜在的なメカニズムとしてミトコンドリアの機能低下と病理に焦点を当ててください。 ,32,33。仮説は、糖尿病が皮膚神経の感覚の投射内ミトコンドリアの分布を変更します。したがって、視覚化し、表皮内神経線維 (IENFs)、後根神経節感覚求心性神経の遠位先端内ミトコンドリアを定量化する技術が開発されました。技法を組み合わせた神経固有の分布を測定する強力な 3 D 画像解析ソフトウェアで信号の共焦点顕微鏡 z シリーズ取得特定のミトコンドリアと神経線維のラベルの蛍光免疫組織化学この目標を達成するために人間の皮膚パンチ生検からミトコンドリア。

Protocol

皮膚パンチ生検はユタ大学糖尿病センター (ソルト レイク シティ, ユタ州) で大規模な地域密着型のプライマリ ・ ケア ネットワークから募集された被験者から得られました。本研究はミシガン大学制度検討委員会で承認され、ヘルシンキ宣言の原則を遵守します。テスト前に各教科からインフォームド コンセントを得たクチします。 1 蛍光免疫組織化学 …

Representative Results

可視化と人間 IENFs 内ミトコンドリアの定量化 蛍光免疫染色により, 神経, ミトコンドリアと核を視覚化する人間の皮膚生検内複数信号の同時表示が可能です。96 ウェル プレートは、免疫組織染色の手順を整理するための便利な方法です。図 1は、ソリューションの 12 段階を通じて処理す…

Discussion

このプロトコルを特定、定量化、サイズと人間の皮膚生検から 3 D で IENFs 内神経固有ミトコンドリアの分布を分析し設計されています。プロトコルのいくつかの重要な手順があります。浮遊蛍光免疫組織化学染色、各サンプルでは、探索的研究44,45より汎用性の高い方法論を提供することで複数の信号を分析して設計されています。この手順は、共…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国立機関の健康補助金 K08 NS061039-01A2、神経研究のためのプログラムによって支えられた & 探索、および、A. アルフレッド Taubman 医療研究所、ミシガン大学の。この作業には、形態と国内機関の健康の付与 5 P 90 DK-20572 国立糖尿病・消化器・腎臓病からによって資金を供給、ミシガン州糖尿病研究センターの画像解析コアが使用されます。著者感謝したい j. ロビンソン シングルトンとゴードン ・ スミス (ユタ大学) ヒトの皮膚のサンプルの寛大な寄付のため。

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
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Keywords: 3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications
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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
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