Tredimensjonale Imaging og analyse av mitokondrier i menneskelig Intraepidermal Nerve Fibre
Summary
Denne protokollen bruker tredimensjonale (3D) bildebehandling og analyse teknikker å visualisere og kvantifisere nerve produktspesifikk mitochondria. Teknikkene gjelder for andre situasjoner der en fluorescerende signal brukes til å isolere et delsett med data fra en annen fluorescerende signal.
Abstract
Målet med denne protokollen er å studere mitokondrier i intraepidermal nerve fibre. Derfor ble 3D bildebehandling og analyse teknikker utviklet for å isolere nerve-spesifikke mitokondrier og evaluere sykdom-induserte endringer av mitokondrier i den distale tuppen på sensoriske nerver. Protokollen kombinerer fluorescens immunohistochemistry, AC confocal mikroskopi og 3D image analyseteknikker å visualisere og kvantifisere nerve produktspesifikk mitochondria. Detaljerte parametere er definert gjennom fremgangsmåten for å gi en konkret eksempel på hvordan du bruker disse teknikkene til å isolere nerve produktspesifikk mitochondria. Antistoffer ble brukt til å merke nerve og mitokondrie signaler i vev deler av huden punch biopsier, som ble etterfulgt av indirekte immunofluorescence å visualisere nerver og mitokondrier med en grønn og rød fluorescerende signal henholdsvis. Z-serien bildene ble anskaffet med AC confocal mikroskopi og 3D analyseprogramvare ble brukt til å behandle og analysere signaler. Det er ikke nødvendig å følge nøyaktig parameterne som beskrives i, men det er viktig å være i samsvar med de valgt gjennom farging, oppkjøp og analyse. Styrken i denne protokollen er at det er gjelder for en rekke tilfeller der en fluorescerende signal brukes til å isolere andre signaler som ellers ville være umulig å studere i fred.
Introduction
Mitokondrier tjene vitale cellulære funksjoner som inkluderer produserer celle energi, bufring kalsium, og regulerer necrotic og apoptotisk celle død1,2,3. Nervesystemet er en høy metabolske rate i forhold til kroppen4 antyder at nervecellene generere en høy grad av cellular energi i form av adenosin trifosfat (ATP) gjennom mitokondrie åndedrett. Mye bevis dokumenter at neuronal funksjoner er avhengige av ATP5, spesielt på synapser6. Fordelingen av mitokondrier i neurons er derfor viktig.
De siste 10 årene mye informasjon har vist at handel med og dokking av neuronal mitokondrier regulerte sterkt. Motoren proteiner er involvert i å distribuere mitokondrier til bestemte mobilnettet rom gjennom Nevron. Smugling av mitokondrier er spesielt viktig fordi neurons prosjekt axons og dendrites langt unna soma. Kinesin motoren proteiner direkte primært anterograd (fra soma) smugling av mitokondrier langs piskehale som henger mens dynein motoren proteiner direkte retrograd (mot soma) motilitet7,8,9 , 10. det er mobilnettet signaler slik mitokondrie membran potensial og impuls ledning som påvirker tilstedeværelse og retning mitokondrie menneskehandel11,12,13.
I tillegg transport mitokondrier, finnes det spesialiserte proteiner å lokalisere mitokondrier til bestemte mobilnettet rom som har høy energi krav, som noder i Ranvier og synapser8,14, 17. flertallet av mitokondrier i axons er faktisk ikke-motile9,13,18. Spesialiserte proteiner som syntaphilin anker mitokondrier til piskehale som henger sammen axons mens andre proteiner anker mitokondrier begrepsordbok cytoskjelett19–21. Vekstfaktorer og ioner som kalsium er rapportert å støtte opphør av mitokondrier bevegelsen å lokalisere dem til områder der de er nødvendige21,22,23.
Samlet er menneskehandel og docking av mitokondrier avgjørende for riktig funksjon av nevroner. Dette har avbrudd i mitokondrie menneskehandel blitt assosiert med flere nevrologiske lidelser inkludert Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom, Huntingtons sykdom, arvelig spastisk paraparesis og optisk atrofi,15,,24,,25,,26,,27. Nyere studier har fokusert på mitokondrie dysfunksjon og patologi som en potensiell mekanisme for diabetisk nevropati, sensoriske tap forbundet med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen er at diabetes endrer fordelingen av mitokondrier i Sensorisk anslagene av cutaneous nerve slutt. Derfor utviklet en teknikk for å visualisere og kvantifisere mitokondrier i intraepidermal nervefibrene (IENFs), den distale tips dorsal root ganglion sensoriske afferente. Teknikken kombinerer fluorescens immunhistokjemi av spesifikke mitokondrie og nerve fiber etiketter med AC confocal mikroskopi z-serien oppkjøpet av signaler med kraftig 3D image analyseprogramvare å måle fordelingen av nerve-spesifikke mitokondrier fra menneskelige kutan punch biopsies å oppnå dette målet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er utformet for å isolere, kvantifisere og analysere størrelse og distribusjon av nerve-spesifikke mitokondrier i IENFs i 3D fra menneskelig hud biopsies. Det er flere viktige skritt i protokollen. Frittflytende fluorescens immunohistochemistry er beregnet på flekken og analysere flere signaler i hver prøve, gir en mer allsidig metode for utforskende forskning44,45. Denne prosedyren gir gjennomtrengning av antistoffer til vev for å maksimer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse tilskudd K08 NS061039-01A2, The Program for nevrologi forskning & funn, og A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbeidet brukte morfologi og Image Analysis kjernen i Michigan Diabetes Research Center, finansiert av nasjonale institutter for helse gi 5P 90 DK-20572 fra National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer. Forfatterne ønsker å takke J. Robinson Singleton og A. Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donasjonen av menneskelig hud prøver.
Materials
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
Referências
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
- Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
- Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
- Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
- Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
- Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
- Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
- Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
- Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
- Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
- Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
- Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
- Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
- Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
- Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
- Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
- Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
- Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
- Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
- Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
- Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
- Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
- Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neurociência. 238, 258-269 (2013).
- Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
- Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
- Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
- Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
- Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
- Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).
