의 생리적 반응을 측정<em> 초파리</em> 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
포유 동물과는 달리, 이러한 초파리와 같은 곤충은 여러 맛 기관이있다. 다리, 코, 날개 초파리의 산란관의 화학 감각 뉴런 미각 수용체 1,2, 이온 채널 3-6, 휘발성 및 비 휘발성 감각 큐의 검출에 참여하는 이온 성 수용체 (7)를 표현한다. 이 신경 세포는 직접 식품, 유해 물질 및 페로몬 등 tastants 문의 따라서 이러한 공급, 달걀 누워와 결합 많은 복잡한 행동에 영향을 미친다. 전극 기록 칼슘 촬상 널리 이러한 tastants 의해 유발 된 신경 세포 반응을 정량화하는 곤충에 사용되어왔다. 그러나, 전기 생리학은 세포 유형, 크기 및 위치에 따라 기술적으로 어려울 수있는 하나의 맛 sensillum 특화된 장비 및 구하는 측정을 필요로한다. 또한, 초파리에서 단일 신경 세포 해상도는 맛 sensilla 허우 때문에 달성하기가 어려울 수 있습니다화학 감각 신경 세포의 자체 이상의 유형입니다. 여기에 설명 된 실시간 칼슘 이미징 법 라이브 파리 단일 미각 뉴런의 반응을 측정 할 수있다. 이 방법은 수성 용매에 대한 낮은 용해도를 지질 페로몬 및 기타 리간드 유형의 연결 반응을 영상화에 특히 적합하다.
Introduction
동물들은 생존과 재생에 필수적인 의사 결정을 중재하는 후각과 미각 정보에 의존합니다. 감지 신경계에 의해 처리하는 방법을 화학 감각 단서 이해하는 감각 수용체 (들) 및 해당 화학 리간드의 확인이 필요합니다. 초파리는 휘발성 및 비 휘발성 화합물의 엄청난 다양성을 감지하고 생리를 연구하기에 좋은 모델입니다 메커니즘은 chemosensation을 기본. 후각 기관은 휘발성 분자를 감지하는 동안, 미각 기관은 낮은 휘발성 화합물을 검출하는 전문으로하고 있습니다. 여기서는 직접 저 휘발성 친 리간드 초파리 melanogaster의 맛 기관에서 신경 반응을 측정하는 방법을 제시한다.
파리의 미각 기관은 앞다리, 코, 날개 등이 있습니다. S 응답 sensilla 알려진 모발 형 구조는 미각 기관의 표면에 분포ugars, 쓴 맛, 소금, 물, 페로몬 8. sensilla 맛 강모으로 형태 학적으로 분류 된 맛은 9 쐐기. 긴 (L 형)으로 분류 된 labellum에 약 31 맛 강모, 짧은 (S 형) 및 중간 (i 형) 모폴로지가 있습니다. 설탕에 생리 학적 반응하는 'L'과 '의'sensilla 집 4 감각 뉴런 (S 셀), 저염합니다 (L1 세포), 높은 소금과 쓴맛 화합물 (2 계층 셀) 및 물 (승 전지) (10) 11. 다른 응답 동안 높은 소금 (12)에 낮은 소금과 설탕에 모두 응답 하나의 '난'sensilla 집이 감각 뉴런,. 남성의 약 41 맛 sensilla와 앞다리에 각각 분산 여성 26 sensilla이 있습니다. 둘 다 남성과 여성의 경우, midleg 21 sensilla 및 뒷다리 (13)에 대해 22 sensilla있다. 다리에 맛 sensilla로 둘러싸인 미각 신경 세포도 다 있습니다L1, L2, W 및 S 타입으로 lassified.
단일 뉴런에서 전기적 활성도를 측정하기위한 하나의 표준 방법은 이온 흐름을 기록하는 세포 또는 세포의 전극을 사용한다. 전극 측정은 신경 기능은 초파리 종, 나방, 신경 라벨링에 대한 광범위한 유전 적 도구가 부족 꿀벌로 비 모델 생물에서 공부 할 수 있습니다. 전기 생리 학적 방법을 일상적으로이 방법을 적용 4,13,14 sensilla 초파리 맛의 활동을 측정하는 데 사용되었지만 그러나, 여러 기술적 과제를 제시한다. 먼저, 칫솔모가 형태학 및 공간적 위치에 기초하여 식별되어야 맛. 식별되면, 전기 생리 학적 측정은 sensilla의 작은 크기에 의해 방해 될 수 의한 위치로 액세스 가능성을 제한 및 맛 화학적 자극 제어 된 양을 적용하는데 어려움이 모. 또한 sensilla의 자극은 하나 이상의 신호를 생성 할 수있다신경 세포 유형 15. 둘째, 전기 신호의 검출은 전자 기기로부터의 기계적인 진동과 노이즈로 인한 배경 잡음에 의해 혼동 될 수있다. 잘못 사용되는 경우 14 번째, 날카롭게 전극의 사용은 플라이 제조를 손상 할 수있다. 마지막으로, 전기 생리학 장비를 조립하는 자극 전달, 신호 기록 및 데이터 분석을위한 특수한 전자 부품을 필요로하고 비용이 많이들 수있다.
D.에서 melanogaster의 유전자 인코딩 툴의 가용성은 뉴런의 작은 집단의 반응을 조사 할 수 있도록 영상 기술의 발달을 촉진 하였다. 하나의 이러한 접근은 CaLexA 기자 (16)의 사용이다. 이 방법에서는 LEXA-VP16 전사 인자 및 칼슘 민감성 NFAT 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 융합된다. 단백질 포스파타제 칼시 뉴린의 칼슘 활성화 차례, facilita에서 NFAT의 탈 인산화를 촉진하고핵으로의 수입을 TES. 핵 내부에서 LEXA 도메인 따라서 기능적으로 활성화 된 뉴런의 지속적인 식별을 허용, 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자의 발현을 지시하는 LexAop-DNA 결합 모티프에 결합한다. 이 접근법은 취기 (16)에 라이브 파리 노광 다음 더듬이 로브 특정 후각 사구체의 응답을 측정하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 최근 IR52c 미각 수용체 신경의 생리적 반응은 CaLexA 7을 사용하여 실시간 파리에서 측정 하였다. 최대 6 주 GFP의 전사를 향상시키기위한 그러나,이 연구를 위해,이 나이에 파리에 필요했다. 항 GFP 항체로 면역 염색하면 CaLexA 신호를 강화하는데 사용될 수 있지만,이 방법에 따라서, 라이브 세포 이미징을위한 가능성을 배제 조직의 고정을 필요로한다.
유 전적으로 인코딩 된 칼슘 표시기 단백질 GCaMP는 광범위의 숫자에 신경 반응을 연구하는 데 사용되었습니다종 17. 단백질 GCaMP은 신경 자극하기 전에 낮은 강도와 형광. 자극의 적용은 칼슘의 유입의 결과로 신경 세포의 활동 전위를 트리거합니다. 칼슘 결합 GCaMP, 그것은 밝게 강도 (그림 1)과 형광 원인, 구조적 변화를 겪는다. 최근에 개발 된 단일 뉴런 칼슘 촬상 방법은 앞다리 특정 Gr61a의 미각 신경 (18)에 대한 리간드로서 포도당을 식별하는 데 사용 하였다. 본 연구에서는 Gr61a의 미각 뉴런 GCaMP 발현 형질 전환 초파리 해부 앞다리는 촬상 전에 아가의 층으로 덮었다. 그러나, 해부 조직의 사용에 따라서 측정 시간 및 검출 감도를 제한 GCaMP 발현의 최종 런을 일으킬 수있다. 또한, 아가로 인해 높은 형광 배경 레벨 및 광 산란 특성에 감도를 제한 할 수 있습니다.
티ㅇ 이러한 단점들을 해결, 우리는 앞다리와 코 그대로 동물의 미각 신경 세포의 생리적 반응을 기록하는 GCaMP 매개 칼슘 이미징의 사용을 설명합니다. 우리는 초파리 지질 페로몬 유 전적으로 인코딩 GCaMP5G 19 발현 생리 Gr68a의 반응과 ppk23 뉴런 (3 R, (11) Z 19 Z) -3- 아세 톡시 11,19-octacosadien -1- 올 (CH503) 20 표시 21. 신경 반응은 페로몬 자극 동안 GCaMP5G 형광 신호의 증가를 정량함으로써 측정된다. 이 프로토콜에서, 신경 세포에서 신경 개별 활성화 패턴을 구별하기에 충분한 120 초 총 지속 기간 동안 영상화된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 2 개의 다른 감각 기관에 초파리 주변 신경 세포의 라이브 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 칼슘 2 +는 CH503은 용량 의존적 양적했다 페로몬 리간드에 의해 유도 Gr68a – 뉴런에서 GCaMP 형광 반응을 -evoked. 이 같은 phasic와 토닉 응답 등의 다른 신경 응답 패턴을 식별하는 것이 가능했다.
phasic 반응을 나타내는 신경 연속 자극에 빠른 적응?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Referências
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