Mesurer les réponses physiologiques de<em> Drosophila</em> Neurones sensoriels à Lipid Phéromones Utilisation en direct d'imagerie de calcium
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
Contrairement aux mammifères, les insectes tels que la drosophile ont plusieurs organes de goût. Les neurones chimiosensorielles sur les jambes, les proboscidiens, les ailes et tarière de Drosophila expriment des récepteurs gustatifs 1,2, canaux ioniques 3-6, et les récepteurs ionotropiques 7 qui sont impliqués dans la détection des signaux sensoriels volatiles et non-volatiles. Ces neurones contacter directement tastants tels que la nourriture, les substances et les phéromones nocives et influencent donc beaucoup de comportements complexes tels que l'alimentation, la ponte et l'accouplement. enregistrements d'électrodes et de l'imagerie de calcium ont été largement utilisés dans les insectes pour quantifier les réponses neuronales évoquées par ces sapides. Cependant, l'électrophysiologie nécessite un équipement spécialisé et des mesures d'obtention d'un seul sensille goût peut être techniquement difficile en fonction du type cellulaire, la taille et la position. En outre, la résolution de neurone unique chez la drosophile peut être difficile à atteindre puisque le goût sensilla houSE plus d'un type de neurone chémosensoriel. Procédé d'imagerie en temps réel de calcium décrite ici permet aux réponses des neurones gustatifs simples dans les mouches vivantes à mesurer. Ce procédé est particulièrement adapté pour imager les réponses neuronales aux phéromones lipides et d'autres types de ligands qui ont une faible solubilité dans les solvants à base d'eau.
Introduction
Les animaux comptent sur l'information olfactive et gustative à la médiation des décisions essentielles pour la survie et la reproduction. Comprendre comment les indices chemosensory sont détectées et traitées par le système nerveux exige l' identification du récepteur (s) sensoriel et les ligands chimiques correspondants. Drosophila détecter une variété stupéfiante de composés volatiles et non-volatiles et sont un excellent modèle pour étudier l' état physiologique mécanismes sous-jacents chemosensation. Alors que les organes olfactifs perçoivent des molécules volatiles, les organes gustatifs sont spécialisés pour détecter des composés à faible volatilité. Ici, nous présentons une méthode pour mesurer directement les réponses neuronales des organes du goût de Drosophila melanogaster à faible volatilité, les ligands lipophiles.
organes gustatifs de la mouche comprennent les pattes antérieures, proboscis et les ailes. Distribué à la surface des organes de goût sont des structures ressemblant à des cheveux appelés sensilles qui répondent aux sugars, bitters, les sels, l' eau et les phéromones 8. Le sensilles ont été classés morphologiquement en poils de goût et le goût des pegs 9. Il y a environ 31 poils de goût sur le labelle qui sont classés dans le (type l) de long, court (type s) et (de type i) morphologies intermédiaires. Sensilla maison 4 neurones sensoriels «L» et «s qui répondent physiologiquement à sucre (la cellule S), faible teneur en sel (la cellule L1), en sel et des composés amers (la cellule L2) et de l' eau (la cellule W) 10 , 11. Les «i» maison 2 neurones sensilles sensoriels, dont répond à la fois à faible teneur en sel et de sucre, tandis que l'autre répond à haute teneur en sel 12. Il y a environ 41 goût sensilles chez les hommes et 26 sensilles chez les femelles répartis sur chacune des pattes. Pour les deux hommes et les femmes, il y a 21 sensilles sur le midleg, et environ 22 sensilles sur la patte arrière 13. Les neurones gustatifs clos par le sensilles du goût sur les jambes sont aussi classified en types L1, L2, W et S.
Une méthode standard pour mesurer l'activité électrique de neurones isolés utilise des électrodes extracellulaires ou intracellulaires pour enregistrer le flux d'ions. Mesures d'électrodes permettent la fonction neuronale à étudier dans les organismes non-modèles tels que les espèces de drosophile, les papillons et les abeilles qui manquent des outils génétiques étendus pour l' étiquetage neural. Cependant, alors que les méthodes électrophysiologiques ont été couramment utilisés pour mesurer l' activité de Drosophila goût sensilla 4,13,14, en appliquant cette approche présente plusieurs défis techniques. Tout d'abord, le goût des poils doivent être identifiés sur la base de la morphologie et la localisation spatiale. Après identification, les mesures électrophysiologiques peuvent être entravées par la petite taille de l'sensilla, l'accessibilité limitée en raison de la position, et la difficulté à appliquer des volumes contrôlés d'un stimulus chimique à un goût de poils. En outre, la stimulation de sensilles peut générer des signaux de plus d'unneuronal de type 15. Deuxièmement, la détection de signaux électriques peut être confondu par le bruit de fond résultant des vibrations mécaniques et le bruit des équipements électroniques. Troisièmement, l'utilisation d'une électrode affûtée peut endommager la préparation du vol, si elle est utilisée de façon incorrecte 14. Enfin, l'assemblage d'un appareil de électrophysiologie nécessite des composants électroniques spécialisés pour la livraison de relance, l'enregistrement du signal, et l'analyse de données et peut être coûteux.
Dans D. melanogaster, la disponibilité des outils génétiquement encodés a facilité le développement des techniques d'imagerie qui permettent les réponses des petites populations de neurones à étudier. Une telle approche est l'utilisation de la journaliste CaLexA 16. Dans ce procédé, les séquences de gènes codant pour le facteur de transcription VP16-LexA et une protéine sensible NFAT de calcium sont fondus ensemble. l'activation de calcium de la calcineurine protéine phosphatase de catalyse la phosphorylation de NFAT et, à son tour, facitES son importation dans le noyau. A l'intérieur du noyau, le domaine LexA se lie à un motif de liaison LexAop-ADN qui dirige l'expression d'une protéine fluorescente (GFP) reporteur verte, permettant ainsi l'identification durable de neurones fonctionnellement activés. L'approche a été utilisée avec succès pour mesurer la réponse des glomérules olfactifs spécifique dans le lobe antennaire après une exposition de mouches vivantes à un odorant 16. Récemment, les réponses physiologiques des neurones récepteurs gustatifs de IR52c ont été mesurées à partir de mouches en direct en utilisant CaLexA 7. Cependant, pour cette étude, il était nécessaire de vol d'âge jusqu'à 6 semaines pour améliorer la GFP transcription. Bien que immunocoloration avec un anticorps anti-GFP peut être utilisé pour amplifier le signal CaLexA, cette méthode nécessiterait la fixation des tissus, excluant ainsi la possibilité pour l'imagerie des cellules vivantes.
Calcium protéine indicatrice GCaMP codé génétiquement a également été largement utilisée pour étudier les réponses neuronales dans un certain nombre d'17 espèces. La GCaMP protéine fluoresce avec une faible intensité avant la stimulation neuronale. Application d'un stimulus déclenche un potentiel d'action dans les neurones, ce qui entraîne l'influx de Ca 2+. GCaMP, liés au Ca 2+, subit un changement de conformation, ce qui provoque la fluorescence avec une intensité plus claire (figure 1). Un seul neurone approche d'imagerie de calcium récemment mis au point a été utilisé pour identifier le glucose comme ligand pour les neurones gustatifs de patte spécifiques Gr61a 18. Dans cette étude, les pattes antérieures disséqués à partir de Drosophila exprimant GCaMP transgénique dans les neurones gustatifs Gr61a ont été recouvertes d'une couche d'agarose avant la formation d' image. Cependant, l'utilisation de tissus disséqués peut causer une éventuelle diminution de l'expression GCaMP, limitant ainsi le temps de mesure et de la sensibilité de détection. En outre, l'agarose peut limiter la sensibilité en raison de niveaux de fond élevés de fluorescence et de ses propriétés de diffusion de la lumière.
To résoudre certains de ces inconvénients, nous décrivons l'utilisation de l'imagerie calcique GCaMP médiation pour enregistrer les réponses physiologiques de patte et proboscis neurones gustatifs des animaux intacts. On montre les réponses physiologiques de Gr68a et les neurones exprimant ppk23 codés génétiquement GCaMP5G 19 à un lipide phéromone chez la drosophile, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acétoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. les réponses neuronales sont mesurées par la quantification de l'augmentation de la fluorescence du signal GCaMP5G lors de la stimulation de la phéromone. Dans ce protocole, les neurones sont imagées pour une durée totale de 120 secondes, ce qui est suffisant pour différencier les modes d'activation neuronale dans des cellules individuelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l' imagerie calcique en direct des neurones périphériques drosophile dans 2 organes sensoriels différents. Ca2 + -evoked GCaMP réponses fluorescentes dans Gr68a-neurones induite par le ligand de phéromone CH503 étaient dose-dépendante et quantitative. Il était également possible de discerner différents modèles tels que phasique et réponses toniques réponse neurale.
Neurones montrant les réponses phasiques s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Referências
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
