Misurare risposte fisiologiche di<em> Drosophila</em> Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
A differenza dei mammiferi, insetti come Drosophila hanno più organi del gusto. I neuroni chemosensoriali sulle gambe, proboscide, ali e ovipositor di Drosophila esprimono recettori gustativi 1,2, canali ionici 3-6, e recettori ionotropici 7 che sono coinvolti nella rilevazione di segnali sensoriali volatili e non volatili. Questi neuroni contattare direttamente tastants come il cibo, sostanze e feromoni influenzano nocivi e quindi molti comportamenti complessi come l'alimentazione, la deposizione delle uova e l'accoppiamento. registrazioni elettrodi e l'imaging di calcio sono stati ampiamente utilizzati negli insetti per quantificare le risposte neuronali evocati da queste sostanze sapide. Tuttavia, elettrofisiologia richiede attrezzature specializzate e le misurazioni ottenere da un singolo sensillum gusto può essere tecnicamente impegnativo a seconda della cellula-tipo, le dimensioni e la posizione. Inoltre, la risoluzione neurone singolo in Drosophila può essere difficile da realizzare, poiché il gusto sensilla House più di un tipo di chemosensory neurone. Il metodo di imaging di calcio in diretta qui descritta permette risposte dei singoli neuroni gustative in mosche in tensione da misurare. Questo metodo è particolarmente adatto per l'imaging risposte neuronali a feromoni lipidici e altri tipi di ligandi che hanno una bassa solubilità in solventi a base acquosa.
Introduction
Gli animali si basano su informazioni olfattive e gustative di mediare decisioni essenziali per la sopravvivenza e la riproduzione. Capire come spunti chemosensory vengono rilevati ed elaborati dal sistema nervoso richiede l'identificazione del recettore sensoriale (s) e le corrispondenti leganti chimici. Drosophila rilevare una varietà impressionante di composti volatili e non volatili e sono un modello eccellente in cui studiare il fisiologico meccanismi sottostanti chemosensation. Mentre gli organi olfattivi percepiscono molecole volatili, gli organi gustativi sono specializzati per rilevare i composti a bassa volatilità. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare direttamente le risposte neuronali dagli organi del gusto di Drosophila melanogaster a bassa volatilità, ligandi lipofile.
organi gustativi della mosca sono le zampe anteriori, proboscide, e le ali. Distribuita sulla superficie degli organi gustative sono strutture simili a capelli noti come sensilla che rispondono al sugars, amari, sali, acqua e feromoni 8. Il sensilla sono stati classificati morfologicamente in setole di gusto e sapore pioli 9. Ci sono circa 31 setole gusto sul labello che sono classificati in lungo (tipo L), breve (s-type) e morfologie (I-tipo) intermedi. Casa sensilla 4 neuroni sensoriali 'L' e 'S' che rispondono fisiologicamente allo zucchero (la cella S), basso contenuto di sale (la cella L1), di sale e composti amari (la cella L2) e l'acqua (la cellula W) 10 , 11. La 'i' Casa 2 neuroni sensoriali sensilli, di cui uno risponde sia a basso contenuto di sale e zucchero, mentre l'altro risponde ad alto sale 12. Ci sono circa 41 gusto sensilli nei maschi e 26 femmine sensilla in distribuite su ciascuno degli arti anteriori. Per entrambi i maschi e femmine, ci sono 21 sensilla sul midleg, e circa il 22 sensilla sul hindleg 13. I neuroni gustative racchiuse dalla sensilla gusto sulle gambe sono anche classified in tipi L1, L2, W e S.
Un metodo standard per misurare l'attività elettrica da singoli neuroni utilizza elettrodi extracellulari o intracellulari per registrare il flusso di ioni. Misure elettrodi permettono la funzione neuronale di essere studiato in organismi non modello, come specie Drosophila, falene, api e che mancano ampi strumenti genetici per l'etichettatura neurale. Tuttavia, mentre i metodi elettrofisiologici sono stati utilizzati di routine per misurare l'attività di Drosophila gusto sensilli 4,13,14, l'applicazione di questo approccio presenta diverse sfide tecniche. In primo luogo, il gusto setole devono essere identificati sulla base di morfologia e posizione spaziale. Dopo l'identificazione, misurazioni elettrofisiologiche possono essere ostacolate dalle piccole dimensioni del sensilli, accessibilità limitata a causa della posizione, e difficoltà nell'applicare volumi controllati di uno stimolo chimico per un gusto setola. Inoltre, la stimolazione di sensilli può generare segnali da più di untipo neuronale 15. In secondo luogo, l'individuazione di segnali elettrici può essere confuso con il rumore di fondo derivanti da vibrazioni meccaniche e rumori provenienti da apparecchiature elettroniche. In terzo luogo, l'uso di un elettrodo affilata può danneggiare la preparazione mosca, se usato in modo errato 14. Infine, montaggio di un impianto di perforazione elettrofisiologia richiede componenti elettronici specializzati per la consegna stimolo, la registrazione del segnale e analisi dei dati e può essere costoso.
In D. melanogaster, la disponibilità di strumenti geneticamente codificati ha facilitato lo sviluppo di tecniche di imaging che consentono le risposte di piccole popolazioni di neuroni da studiare. Un tale approccio è l'uso del reporter CaLexA 16. In questo metodo, sequenze di geni codificanti il fattore di trascrizione LexA-VP16 e NFAT proteina sensibile calcio sono fusi insieme. Attivazione di calcio della calcineurina proteina fosfatasi catalizza la de-fosforilazione di NFAT e, a sua volta, facilitaTES sua importazione nel nucleo. All'interno del nucleo, il dominio LexA lega a un motivo di legame LexAop-DNA che dirige l'espressione di una verde giornalista proteina fluorescente (GFP), permettendo così l'identificazione sostenuta di neuroni funzionalmente attivati. L'approccio è stato utilizzato con successo per misurare la risposta della specifica glomeruli olfattivi nel lobo antenne in seguito all'esposizione di mosche dal vivo ad un odorizzante 16. Recentemente, le risposte fisiologiche di IR52c neuroni recettori gustativi sono stati misurati dalle mosche dal vivo utilizzando CaLexA 7. Tuttavia, per questo studio, è stato necessario mosche di età fino a 6 settimane per migliorare la trascrizione GFP. Mentre immunocolorazione con un anticorpo anti-GFP può essere utilizzato per amplificare il segnale CaLexA, questo metodo richiederebbe fissaggio del tessuto, precludendo così la possibilità per l'imaging live-cell.
Il GCaMP indicatore di proteine calcio geneticamente codificato è anche stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neuronali in diversiSpecie 17. Il GCaMP proteina fluorescente con bassa intensità prima di stimolazione neuronale. L'applicazione di uno stimolo innesca un potenziale d'azione nel neurone, conseguente afflusso di Ca 2+. GCaMP, legato a Ca 2+, subisce un cambiamento conformazionale, provocando la fluorescenza con intensità luminosa (Figura 1). Un approccio di imaging del calcio singolo neurone sviluppato di recente è stato utilizzato per identificare il glucosio come legante per gli specifici neuroni gustative Gr61a zampa anteriore 18. In questo studio, gli arti anteriori sezionati da transgenici Drosophila che esprimono GCaMP nei neuroni gustative Gr61a erano coperti da uno strato di agarosio prima di imaging. Tuttavia, l'uso di tessuto sezionato può causare eventuale carrellata di espressione GCaMP, limitando così il tempo di misura e la sensibilità di rilevazione. Inoltre, agarosio può limitare la sensibilità a causa di alti livelli di fondo di fluorescenza e le sue proprietà di diffusione della luce.
To affrontare alcuni di questi inconvenienti, si descrive l'utilizzo di immagini di calcio GCaMP-mediata per registrare le risposte fisiologiche di zampa anteriore e proboscide neuroni gustative di animali intatti. Noi mostriamo le risposte fisiologiche di Gr68a e neuroni che esprimono ppk23 geneticamente codificato GCaMP5G 19 per un lipide feromone Drosophila, (3 R, 11 Z, Z 19) -3-acetossi-11,19-octacosadien-1-olo (CH503) 20, 21. risposte neuronali sono misurati quantificando l'aumento della fluorescenza del segnale GCaMP5G durante la stimolazione feromone. In questo protocollo, i neuroni vengono esposte per una durata totale di 120 secondi, che è sufficiente a differenziare pattern di attivazione neuronale in singole cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui un metodo per eseguire l'imaging del calcio live di Drosophila neuroni periferici in 2 diversi organi sensoriali. Il Ca 2+ -evoked risposte fluorescenti GCaMP in Gr68a-neuroni indotte dal ligando feromone CH503 erano dose-dipendente e quantitativa. E 'stato anche possibile distinguere diversi modelli di risposta neurale come la fasica e le risposte tonico.
I neuroni che mostrano le risposte fasiche si ritiene di consentire un rapido adattamento agl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
Referências
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