O objetivo deste protocolo é usar a microdissecção por captura a laser como um método eficaz para isolar populações puras de tipos de células de tecidos heterogêneos da próstata para análise de RNA a jusante.
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Artigo de método
Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
A próstata contém um ambiente heterogêneo de tipos de células estromais, epiteliais, neuroendócrinas e imunes. A próstata saudável é composta por estroma fibromuscular em torno de lúmens secretores revestidos de epitelial discretos e uma população muito pequena de células imunes e neuroendócrinas. Em contraste, as áreas de câncer de próstata têm epitélio luminal displásico aumentado com população estromal muito reduzida ou ausente. Dada a profunda diferença entre os tipos de células estromais e epiteliais, é imperativo separar os tipos de células para qualquer tipo de análise molecular a jusante. Apesar desse conhecimento, a maior parte dos estudos de expressão gênica compara a próstata benigna ao câncer sem microdissecção, levando a um viés estromal nas amostras benignas. A microdissecção por captura a laser (LCM) é um método eficaz para separar fisicamente diferentes tipos de células de uma seção de amostra. O objetivo deste protocolo é mostrar que o RNA pode ser isolado com sucesso do epitélio prostático humano coletado por LCM e usado para estudos de expressão gênica a jusante, como RT-qPCR e RNAseq.
Introdução
A próstata é um tecido heterogéneo composto por epitélio secretor dispostos em ácinos glandular rodeado por estroma fibromuscular composto principalmente de músculo liso 1. O compartimento epitelial é composto por cinco tipos de células diferentes, mas organizados: células basais, células secretoras, células neuroendócrinas, células amplificadoras de trânsito e células-tronco 2. No cancro da próstata (CaP), que surge a partir de células epiteliais luminais, o crescimento do adenocarcinoma provoca um declínio progressivo evidente do compartimento estromal 3. Por estas razões, as amostras de tecido terá diferenças distintas na proporção....
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Protocolo
Todos os tecidos humanos utilizados para estas experiências foram adquiridas através de um protocolo aprovado Institutional Review Board e / ou isenção na Universidade de Illinois em Chicago.
1. Seção Fresco Congelado próstata para PEN-slide e para Cobrado placa de vidro
- No dia anterior ou poucas horas antes do corte da amostra, ferramentas limpas (isto é, escova, fórceps, coplins, lâminas, lâminas PEN-emoldurados (se já não estiver RNase livre), um marcador ETOH seguro e um lápis) e no interior de um RT criostato com uma solução de RNase-descontaminação usando um frasco de spray e LAB-toalhetes.
- Permita que a solução de descontam....
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Resultados
Num estudo anterior demonstrou que a utilização de LCM para recolher os tecidos epiteliais e do estroma para comparar perfis de expressão por RT-qPCR de ARNm e microARNs de tecidos da próstata e congelados FFPE a partir do mesmo paciente 4. LCM é demorado, especialmente se grande quantidade de RNA deve ser recolhida para análise de sequenciamento de próxima geração. Portanto, é crucial manter o espaço de trabalho e ferramentas de RNase livre. Recomenda-se para analisar os controlos de qualidade e célula-espec.......
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Discussão
A expressão do gene de perfis a partir de amostras humanas pode ser um desafio, não só para a qualidade ou quantidade de tecido disponível, mas também para as várias entidades histológicas presentes numa determinada amostra de tecido. Isto é particularmente difícil na próstata em que os tecidos benignos são em grande parte tecidos estromais e áreas de cancro são desprovidos de estroma. LCM facilita a separação física do estroma prostático e ARN epitélio para uma assinatura mais preciso dos dois tipos de células diferent.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Vicky Macias, Angeline Giangreco e Avani Vaishnav pela assistência na otimização dessa metodologia ao longo dos anos e a Yang Zhang e ao Dr. Jian Ma da Universidade de Illinois em Urbana-Champaign pela análise de sequência de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo NIH / NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH / NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) e uma bolsa da Prevent Cancer Foundation (Zhou).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrana 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| lâminas de vidro, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Etanol 200 à prova | de laboratórios Decon. | 2701 | |
| DEPC (dietil pirocarbonato) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Frasco de coloração) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Rack de coloração) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® | |
| microdissecção a laser | |||
| de paredes finas de 0,5 ml para LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Kit de isolamento de RNA total | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| ND-1000 | |||
| Qubit 2.0 Fluorômetro | Life Technologies | Q32866 | |
| Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade | Marca Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Marca Thermo Fisher |
| Scientific Coloração de hematoxilina | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | Nº 7111 |
Referências
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12
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Reimpressões e permissões
